핵산 비율의 신속한 탐색을 위해 최적화된 마우스 배아 줄기 세포 기반 역 Poly-transfection 기술

요약

본 프로토콜은 2i 및 LIF 배지를 사용한 배양 중 마우스 배아 줄기 세포의 역 다중-transfection 방법을 설명합니다. 이 방법은 기존의 forward transfection 프로토콜보다 더 높은 생존력과 효율성을 제공하는 동시에 plasmid 비율의 one-pot 최적화를 가능하게 합니다.

초록

상대적으로 단순하고 사용하기 쉽기 때문에 포유류 세포주와 핵산의 일시적인 transfection은 생물 의학 연구의 중심이 되었습니다. 가장 널리 사용되는 세포주는 부착성 2차원 배양에서 transfection을 위한 강력한 프로토콜을 가지고 있지만, 이러한 프로토콜은 종종 연구가 덜 된 세포주 또는 비정형적이고 transfection하기 어려운 형태를 가진 세포주에는 잘 변환되지 않습니다. 재생 의학에 널리 사용되는 배양 모델인 2i/LIF 배지에서 성장한 마우스 만능 줄기 세포를 사용하는 이 방법은 더 높은 transfection 효율을 달성할 수 있는 최적화되고 신속한 역transfection 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜을 활용하여 3-plasmid poly-transfection을 수행하고, plasmid delivery에서 정상보다 높은 효율을 활용하여 확장된 범위의 plasmid 화학량론을 연구합니다. 이 reverse poly-transfection 프로토콜은 one-pot 실험 방법을 허용하여 사용자가 여러 co-transfection이 아닌 단일 웰에서 plasmid 비율을 최적화할 수 있도록 합니다. 이 프로토콜은 전달된 유전 회로의 전체 기능에 대한 DNA 화학량론의 효과에 대한 신속한 탐색을 촉진함으로써 배아 줄기 세포 형질 주입의 시간과 비용을 최소화합니다.

서문

DNA와 RNA를 포유류 세포로 전달하는 것은 생물의학 연구의 핵심 기둥 역할을 합니다¹. 외인성 핵산(NA)을 포유류 세포에 도입하는 일반적인 방법은 일시적인 형질주입(transfection) ^2,3을 이용하는 것입니다. 이 기술은 NA를 수용 세포로 전달할 수 있는 상업적으로 이용 가능한 transfection 시약과 혼합하는 데 의존합니다. 전형적으로, NA는 2차원 표면에 부착된 세포가 transfection 복합체를 받는 forward transfection을 통해 전달됩니다. 가장 일반적으로 확립된 세포주에 대한 전방 transfection은 견고하고 프로토콜이 잘 알려져 있지만, 비단층 형태를 가진 더 많은 틈새 세포 유형은 쉽게 transfection되지 않아 전달할 수 있는 NA의 양과 이를 받는 세포의 수가 제한됩니다.

만능줄기세포(PSC)는 무한정 분열하여 모든 유형의 체세포를 생산할 수 있는 능력을 감안할 때 발달을 이해하는 데 매력적인 모델이자 재생 의학의 도구로 사용됩니다. 마우스 PSC(mPSC)의 경우, 2개의 억제제와 LIF(2i/LIF)를 사용한 일상적인 in vitro 배양 조건은 돔과 같은 콜로니 형태를 유지하여 forward transfection에 노출된 세포의 수를 직접적으로 제한합니다 ^4,5,6. 이를 해결하기 위해, 역방향 transfection을 수행할 수 있다: 부착 세포에 transfection 시약을 첨가하는 대신, 배지 및 transfection 시약을 포함하는 접시에 세포를 첨가한다⁷. 이렇게 하면 시약에 노출되는 세포의 수가 증가하지만, 세포를 동시에 통과하고 형질주입해야 합니다.

단순한 single-NA transfection을 넘어 연구자들은 종종 여러 NA 구조체를 in vitro 세포 집단에 전달하는 것을 목표로 합니다. 이는 전형적으로 NA가 주어진 비율(1:1, 9:1 등)로 혼합된 후 선택된 형질주입 시약⁽⁸)과 결합되는 co-transfection을 통해 달성된다. 이는 NA와 시약의 혼합물을 생성하여 서로에 대한 NA의 원래 비율을 보존합니다 - 처리된 세포는 이 혼합물의 양이 다를 수 있지만 모두 동일한 비율을 받습니다⁹. 이는 원하는 부품 비율을 알고 있을 때 유리하지만, 이 비율을 미리 결정하는 것은 노동 집약적일 수 있으며 각 비율은 서로 다른 조건을 구성합니다. 한 가지 대안은 "poly-transfection"을 수행하는 것인데, 여기서 개별 NA는 서로 독립적으로 transfection 시약과 혼합된다⁹. 개별 NA를 포함하는 형질주입 복합체를 결합함으로써(복합체를 생성하기 전에 NA를 결합하는 대신), 연구자들은 단일 형질주입 실험에서 다양한 NA 화학량론을 탐색할 수 있습니다⁹. 이는 유도성 전사 시스템 또는 ^1,10,11에 내장된 피드백이 있는 시스템과 같이 여러 NA의 산물이 서로 상호 작용할 것으로 예상되는 경우에 특히 유용합니다. 그러나 이를 효과적으로 수행하기 위해서는 높은 transfection 효율이 필요합니다. 실제로, 고유한 transfection된 NA의 수가 증가함에 따라, 주어진 세포가 원하는 모든 NA를 받을 확률은^기하급수적으로 감소합니다 ^9,12.

다음 보고서는 양이온성 지질 기반 transfection 시약을 사용하는 mPSC에 대한 역-transfection 프로토콜에 대해 설명하며, 이 시약에서 세포는 최대 5분 동안 시약-NA 혼합물에 노출되어 생존율을 극대화하고 일반적인 배양 조건을 벗어난 시간을 최소화합니다. 이 프로토콜을 이들 세포의 표준 순방향 transfection과 비교하면 더 높은 transfection 효율과 생존하는 transfection된 세포의 총 수가 증가함을 알 수 있습니다. 이 reverse transfection을 간단한 형광 리포터를 포함하는 three-plasmid poly-transfection과 결합함으로써 높은 transfection 효율로 NA 비율을 스크리닝할 수 있는 확장된 잠재력이 입증되었습니다.

프로토콜

1. mPSC 배양을 위한 시약 준비

1. N2 보충제를 준비합니다.
   1. 비멸균 조건에서는 화학 안전 흄 후드에 다음 원액(단계 1.1.1.1)을 준비합니다. 각 화학 물질의 고체 분말을 사전 칭량된 50mL 원뿔형 튜브에 추가합니다. 분말을 첨가한 후 각 튜브의 무게를 측정하고 적절한 양의 용매를 추가하여 아래 농도를 달성합니다. 한 배치의 용지에 대해 나열된 최소 양을 준비합니다.
      알림: 다음 시약은 위험하므로 현지 화학 안전 지침에 따라 취급해야 합니다. 취급 시 적절한 PPE를 확인하고 흡입을 방지하기 위해 화학 흄 후드에서 이러한 화학 물질의 고체 분말 형태로만 작업하십시오.
      1. 0.518mg/mL의 물에 최소 0.05mL의 셀렌산나트륨, 160mg/mL의 물에 0.5mL의 푸트레신, 0.6mg/mL의 100% 에탄올에 0.165mL의 프로게스테론(재료 표 참조).
      2. 용액을 -20°C에서 최대 2년 동안 보관할 수 있습니다.
   2. 생물안전 작업대(BSC)에서 DMEM-F12 58.035mL에 다음을 추가합니다.
      1. 0.518mg/mL 셀렌산나트륨 용액 0.05mL, 160mg/mL 푸트레신 용액 0.5mL, 0.6mg/mL 프로게스테론 용액 0.165mL.
      2. 0.22μm 필터로 위의 혼합물을 여과 살균합니다.
   3. BSC에서 아포트랜스페린 100mg/mL 용액을 준비합니다.
      1. 5mL의 DMEM-F12를 500mg의 아포트랜스페린에 추가합니다( 재료 표 참조). 기포를 피하면서 용기를 천천히 재현탁하고 세척하십시오.
      2. 재현탁 후 5mL로 최대한 제거한 후 아셀레나이트/푸트레신/프로게스테론 용액에 첨가합니다. 이전 용액을 더 많이 복용하고 아포트랜스페린 병을 씻어 가능한 한 많이 빼냅니다.
   4. 용액에 7.5% BSA 분획 V 5mL( 재료 표 참조)를 추가합니다.
   5. 튜브당 6.875mL를 혼합하고 분취합니다. 부분 표본은 -80 °C에서 최대 1년 동안 보관하십시오.
   6. 위의 N2 부분 표본을 사용하여 N2B27 배지를 만들 때 원하는 부분 표본을 해동하고 100x N2 10mL에 대해 6.875 N2에 4mg/mL 인슐린 용액 3.125mL( 재료 표 참조)를 추가합니다.
2. N2B27 기초 배지를 준비합니다.
   1. N2 및 B27 보충제를 4°C 냉장고에서 몇 시간 또는 밤새 해동합니다.
   2. BSC에서 484.5mL의 DMEM-F12와 484.5mL의 Neurobasal 배지( 재료 표 참조)를 멸균된 1L 병에 혼합합니다.
   3. 배지에 B27 10mL와 N2 보충제 10mL를 추가합니다.
   4. 1mL의 55mM 베타-메르캅토에탄올을 추가합니다( 재료 표 참조). 100x 글루타맥스 10mL를 추가합니다. 병을 휘저어 세게 섞는다.
   5. 부분 표본당 원하는 용량(일반적으로 100mL)을 분취하고 -80°C에서 최대 1년 동안 보관합니다. 4°C에서 해동한 후 최대 3주 동안 보관하십시오.
3. NBiL 배지를 준비합니다.
   1. N2B27 기초 배지 100mL 분취액을 -80°C에서 4°C 냉장고에서 해동합니다.
   2. BSC에서 최종 농도 10μg/L까지 LIF( 재료 표 참조)를 추가합니다.
   3. CHIR99021(3μM 최종) 및 PD0325901(1μM 최종)을 추가합니다( 재료 표 참조). 50mL 혈청학적 피펫과 잘 섞습니다. 4 °C에서 최대 2주 동안 보관하십시오.
4. 0.2 % 젤라틴 용액을 준비합니다.
   1. 이중 증류된 H₂O 500mL를 1L 유리병에 옮깁니다.
   2. 젤라틴 1g을 계량하여( 재료 표 참조) 물에 넣으십시오. 거의 녹을 때까지 병을 흔들어 섞는다.
   3. 젤라틴과 물 혼합물을 15psi, 121°C에서 35분 동안 고압멸균합니다. 냉각이 끝나면 BSC에서 0.22μm 필터로 필터를 멸균합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
5. 세척제를 준비하십시오.
   1. BSC에서 DMEM-F12 10mL당 7.5% BSA 160μL를 혼합합니다.
   2. 위의 크기를 조정하고 나중에 쉽게 사용할 수 있도록 대량으로 준비합니다(예: 7.5% BSA 8mL에서 DMEM-F12 500mL). 4 °C에서 보관하십시오.

2. mPSC poly-transfection을 위한 시약 준비

참고: 다음 값은 24웰 플레이트의 단일 웰에 대해 제공됩니다. 그에 따라 값을 조정할 수 있습니다. 모든 DNA/플라스미드의 염기서열은 보충 파일 1에 자세히 설명되어 있습니다.

1. 처리에 필요한 DNA 용액의 부피를 계산합니다.
   1. 웰/상태당 500ng의 DNA를 준비합니다.
      1. 100 ng/μL의 DNA 용액으로 단일 플라스미드를 transfection하는 경우, 5 μL의 DNA가 들어 있는 튜브 하나를 준비합니다.
      2. 각각 100 ng/μL의 속도로 두 개의 plasmid를 transfection하는 경우, 각 plasmid에 하나씩 각각 2.5 μL가 들어 있는 두 개의 tube를 준비합니다.
2. BSC에서 다음을 수행합니다. 각 500ng transfection 처리( 재료 표 참조)에 대해 25μL의 OptiMEM을 1.5mL 튜브에 분취합니다.
   1. 위의 예에서 각각 250ng의 DNA(2.5μL)와 12.5μL의 OptiMEM이 있는 두 개의 튜브를 준비합니다.
3. 해당 치료에 필요한 양의 DNA를 튜브의 OptiMEM에 추가합니다.
4. 500ng DNA와 OptiMEM이 있는 각 튜브에 대해 25μL의 OptiMEM과 1μL의 양이온성 지질 기반 transfection 시약으로 일치하는 튜브를 만듭니다.
   1. 다시 말하지만, 이러한 값은 그에 따라 조정되어야 합니다. 위의 예에서는 각각 12.5μL의 OptiMEM과 0.5μL의 transfection 시약이 들어 있는 두 개의 튜브를 준비합니다.
      참고: 값을 스케일링할 때 해당 양의 DNA에 필요한 부피가 아닌 추가된 DNA의 질량을 사용하십시오. transfection 시약 및 DNA를 사용한 반응은 스케일링할 수 있습니다(예: 5개의 웰을 동일한 DNA로 transfection해야 하는 경우). 시약의 비율은 동일하게 유지하되 그에 따라 확장합니다(예: 1000ng DNA: 50μL OptiMEM: 2μL transfection 시약: 50μL OptiMEM).

3. transfection을 위한 mPSC의 준비

참고: 역transfection의 경우, transfection 시약을 추가하기 직전에 배양 용기를 준비하고 mPSC를 통과시킵니다. forward transfection의 경우, transfection이 플레이트에 부착될 수 있도록 transfection하기 12-18시간 전에 세포를 통과시키고 플레이트합니다.

1. 0.2% 젤라틴으로 코팅된 세포 배양 용기를 준비합니다.
   1. transfection에 필요한 웰 수를 계획합니다(처리/그룹당 24웰 플레이트의 웰 1개).
   2. 200 μL의 0.2% 젤라틴 용액을 24웰 플레이트의 원하는 각 웰에 추가합니다.
   3. 접시를 부드럽게 흔들어 용액을 고르게 펴서 우물 바닥 전체를 덮도록 합니다.
   4. 웰이 실온에서 최소 15분 동안 코팅되도록 합니다.
   5. 진공 흡입기를 사용하여 웰에서 남은 젤라틴을 조심스럽게 제거합니다(젤라틴 층을 긁어내지 않고 모든 액체를 제거할 수 있도록 플레이트를 기울임).
   6. 각 웰에 0.5mL의 NBiL 배지를 추가하고(1.3단계) 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 넣어 예열합니다.
2. 통로 mPSC.
   1. 세척액 30mL(단계 1.5)를 50mL 코니컬 튜브에 분취합니다.
   2. mESC의 조직 배양 접시에서 오래된 배지를 흡인합니다.
      알림: 몇 가지 흡인 기술이 허용됩니다. 어떤 기술을 선택하든 세포가 장기간(최대 약 30초) 건조한 상태로 유지되지 않도록 하십시오.
   3. 시판되는 세포 분해 배지(10cm 접시의 경우 1.5mL, 그에 따라 스케일링, 재료 표 참조)를 필요한 양으로 추가합니다.
   4. P1000 피펫으로 15-20회 위아래로 피펫팅하기 전에 3-5분 동안 기다렸다가 단일 셀 현탁액을 얻습니다. 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 현미경으로 세포를 관찰합니다.
   5. 탈취 배지의 세포를 세척 배지가 들어 있는 50mL 튜브로 옮깁니다.
   6. 실온에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 세척 매체를 흡입하여 튜브에 잔류 액체가 남아 있지 않도록 합니다.
   7. 펠릿을 소량의 세척제(~300μL)에 재현탁시킵니다. 혈구계를 사용하여 세포 현탁액을 계산하여 세포 밀도를 구합니다.

4. mPSC의 역형주입

1. 2단계에 따라 poly-transfection 시약을 준비합니다.
2. 3단계에 따라 세포 배양 용기 및 통로 mPSC를 준비합니다.
3. 200μL의 NBiL 배지를 1.5mL 튜브에 분취(각 처리당 하나씩).
4. 26μL의 OptiMEM:transfection 시약 혼합물을 DNA:OptiMEM 혼합물에 첨가합니다. 약 10회 피펫팅하여 시약을 빠르고 세게 혼합합니다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다.
5. 세포 밀도에 따라 필요한 부피의 세포를 300μL 세포 현탁액에서 200μL NBiL 튜브로 옮겨 튜브당 25,000개의 세포를 얻습니다.
6. Lipofectamine 2000(L2K, transfection 시약)과 DNA 혼합물을 5분 동안 배양한 후 세포의 1.5mL 튜브에 넣고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 세포를 실온에서 5분 동안 시약으로 배양합니다.
7. 실온에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 약 50μL를 남기고 액체를 피펫으로 제거합니다.
8. 세포 펠릿을 100μL의 NBiL 배지로 재현탁시킵니다. 세포를 플레이트로 옮기고 플레이트를 인큐베이터에 놓습니다. 24시간 후에 새 NBiL 미디어로 미디어를 교체합니다.

5. mPSC의 순방향 transfection

1. transfection을 수행하기 12-18시간 전에 3단계에 따라 세포 배양 용기 및 통로 mPSC를 준비합니다.
2. 세포 밀도에 따라 300μL 세포 혼합물에서 필요한 부피의 세포를 전달하여 웰당 25,000개의 세포를 시드합니다. 플레이트를 인큐베이터에 놓습니다.
3. transfection을 수행하기 1시간 전에 모든 웰에서 배지를 흡인하고 0.5mL의 NBiL 배지로 교체합니다. 플레이트를 인큐베이터에 놓습니다.
4. transfection 시 2단계에 따라 mPSC poly-transfection 시약을 준비합니다.
5. 26μL의 OptiMEM:transfection 시약 혼합물을 DNA:OptiMEM 혼합물에 첨가합니다. 약 10회 피펫팅하여 시약을 빠르고 세게 혼합합니다. 결합된 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다.
6. 결합된 혼합물을 우물에 한 방울 떨어뜨립니다. 플레이트를 인큐베이터에 놓습니다. 24시간 후에 미디어를 교체합니다.

6. 유세포 분석

1. transfection한 후 48시간 후에 transfection된 24웰 플레이트에서 배지를 흡입합니다.
2. 각 웰에 200μL의 트립신을 추가하고 소용돌이치며 37°C에서 30초 동안 배양합니다. 플레이트의 측면을 두드리고 200μL의 얼음처럼 차가운 FACS 완충액(PBS의 2% FBS)을 추가합니다.
3. A96부터 시작하여 V-바닥 1웰 플레이트를 열고 라벨을 붙입니다. 형질주입된 플레이트에서 각 웰의 내용물을 혼합하여 세포를 제거하고 P200 피펫으로 단일 세포 용액을 만듭니다. 각 웰에서 96웰 플레이트의 적절한 웰로 200μL를 옮깁니다.
4. 50mL 시약 저장소에 15mL의 FACS 완충액을 추가합니다. 플레이트를 실온에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 빠르고 부드러운 움직임으로 96웰 플레이트를 싱크대에 뒤집어 상층액을 버립니다.
5. 멀티채널 피펫을 사용하여 시약 저장소에서 150μL의 FACS 완충액에 펠릿을 96웰 플레이트에 재현탁시킵니다. 6.4-6.5단계를 두 번 반복합니다. 96웰 플레이트를 빛으로부터 보호되는 얼음으로 채워진 상자에 넣습니다.
6. 유세포 분석기를 통해 샘플을 실행하여 형광 리포터의 집단 분포를 얻습니다.
   1. 수행할 실험에 대한 레이저 및 필터 조합 측면에서 유세포 분석기가 적절한지 확인합니다(예: 원적색 스펙트럼에서 여기하거나 검출할 수 없는 경우 적외선 리포터를 사용하지 마십시오).
   2. 분석 중 MEFL 데이터 변환을 허용하기 위해 표준화 비드에 대한 추가 샘플을 포함합니다. 적절한 통계 분석을 위해 샘플당 충분한 세포가 수집되었는지 확인⁹.
7. 원시 유세포분석기 파일에서 형광 단위를 변환하고 Python 또는 MATLAB 기반 파이프라인이나 상용 소프트웨어 ^9,13과 같은 여러 가지 방법 중 하나를 사용하여 데이터를 분석합니다.

결과

순방향 및 역방향 transfection은 모두 세포막과 incoming transfection 시약-DNA 복합체 사이의 상호 작용에 의존하여 NA를 수용 세포에 전달할 수 있습니다. 이러한 기법이 다른 점은 전달 시 세포의 상태입니다 - DNA는 일반적으로 기존의 순방향 transfection에서 부착 세포 단층으로 전달되는 반면, 역방향 transfection은 대신 단일 세포 현탁액에서 시약-DNA 복합체가 세포와 만나도록 하는 데 의존합니다. 이러한 ?...

토론

transfection 프로토콜이 널리 채택되는 주요 이유는 재현성과 접근성입니다. 그러나 이러한 프로토콜은 실험 컨텍스트 전반에 걸쳐 최적화가 필요합니다. 새로운 세포주를 처음으로 transfection하려고 할 때 필요한 표준 검사는 위에 언급되지 않았습니다. 첫째, 시중에서 판매되는 시약은 만능이 아니며 세포 유형에 따라 NA 전달 생존력의 효율성이 다르기 때문에 transfection 시약의 선택이 중요합니다. ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrin	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044
Beta-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	21985023
BSA fraction V (7.5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beads	Spherotech	URCP-38-2K
Gelatin	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Insulin	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent
Neurobasal media	ThermoFisher Scientific	21103049
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesterone	MilliporeSigma	P8783	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Sodium selenite	MilliporeSigma	S5261-25G	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200056