Nükleik Asit Oranlarının Hızlı Araştırılması için Optimize Edilmiş Bir Fare Embriyonik Kök Hücre Tabanlı Ters Poli-Transfeksiyon Tekniği

Özet

Mevcut protokol, 2i ve LIF ortamı ile kültür sırasında fare embriyonik kök hücrelerinin ters poli-transfeksiyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yöntem, geleneksel ileri transfeksiyon protokollerinden daha yüksek canlılık ve verimlilik sağlarken, aynı zamanda plazmit oranlarının tek kap optimizasyonunu da sağlar.

Özet

Göreceli basitliği ve kullanım kolaylığı nedeniyle, memeli hücre hatlarının nükleik asitlerle geçici transfeksiyonu, biyomedikal araştırmalarda bir dayanak noktası haline gelmiştir. Yaygın olarak kullanılan hücre hatlarının çoğu, yapışık iki boyutlu kültürde transfeksiyon için sağlam protokollere sahip olsa da, bu protokoller genellikle daha az çalışılmış hatlara veya atipik, transfekte edilmesi zor morfolojilere sahip olanlara iyi tercüme edilmez. Rejeneratif tıp için yaygın olarak kullanılan bir kültür modeli olan 2i/LIF ortamında büyütülen fare pluripotent kök hücrelerini kullanan bu yöntem, daha yüksek transfeksiyon verimliliği elde edebilen optimize edilmiş, hızlı bir ters transfeksiyon protokolünü ana hatlarıyla belirtir. Bu protokolden yararlanarak, genişletilmiş bir plazmit stokiyometri aralığını incelemek için plazmit dağıtımındaki normalden daha yüksek verimlilikten yararlanılarak üç plazmit poli-transfeksiyonu gerçekleştirilir. Bu ters poli-transfeksiyon protokolü, kullanıcıların plazmit oranlarını birkaç ko-transfeksiyon yerine tek bir kuyuda optimize etmelerini sağlayan tek kap deneysel bir yönteme izin verir. DNA stokiyometrisinin iletilen genetik devrelerin genel işlevi üzerindeki etkisinin hızlı bir şekilde araştırılmasını kolaylaştırarak, bu protokol embriyonik kök hücre transfeksiyonunun süresini ve maliyetini en aza indirir.

Giriş

DNA ve RNA'nın memeli hücrelerine verilmesi, biyomedikal araştırmaların temel direği olarak hizmet eder¹. Ekzojen nükleik asitleri (NA) memeli hücrelerine sokmak için yaygın bir yöntem, geçici transfeksiyon ^2,3'tür. Bu teknik, NA'nın alıcı hücrelere iletebilen ticari olarak temin edilebilen transfeksiyon reaktifleri ile karıştırılmasına dayanır. Tipik olarak, NA, iki boyutlu bir yüzeye yapışan hücrelerin transfeksiyon kompleksini aldığı ileri transfeksiyon yoluyla iletilir. En yaygın olarak kurulan hücre hatları için ileri transfeksiyon sağlam ve protokoller iyi ya....

Protokol

1. mPSC kültürü için reaktiflerin hazırlanması

1. N2 takviyesi hazırlayın.
   1. Steril olmayan koşullarda, bir kimyasal güvenlik çeker ocakta aşağıdaki stok çözeltilerini (adım 1.1.1.1) hazırlayın. Her kimyasalın katı tozunu önceden tartılmış 50 mL'lik bir konik tüpe ekleyin. Tozu ekledikten sonra her bir tüpü tartın ve aşağıdaki konsantrasyonları elde etmek için uygun miktarda çözücü ekleyin. Bir parti medya için, listelenen minimum miktarı hazırlayın.
      NOT: Aşağıdaki reaktifler tehlikelidir ve yerel kimyasal güvenlik yönergelerine uygun olarak kullanılmalıdır. Kullanım sırasında uygun KKD'yi sağlayın ve solunmasını önlemek için yalnızca b....

Tartışmalar

Transfeksiyon protokollerinin yaygın olarak benimsenmesinin temel nedeni, tekrarlanabilirlikleri ve erişilebilirlikleridir; Ancak, bu protokoller deneysel bağlamlarda optimizasyon gerektirir. Yukarıda bahsedilmeyen, yeni bir hücre hattını ilk kez kesmeye çalışırken gerekli olan standart testtir. İlk olarak, transfeksiyon reaktifi seçimi çok önemlidir, çünkü ticari olarak temin edilebilen reaktifler herkese uyan tek bir beden değildir ve hücre tipleri arasında NA iletim canlılığının verimliliğin.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrin	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044
Beta-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	21985023
BSA fraction V (7.5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beads	Spherotech	URCP-38-2K
Gelatin	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Insulin	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent
Neurobasal media	ThermoFisher Scientific	21103049
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesterone	MilliporeSigma	P8783	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Sodium selenite	MilliporeSigma	S5261-25G	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200056