Una tecnica di politrasfezione inversa ottimizzata basata su cellule staminali embrionali di topo per una rapida esplorazione dei rapporti degli acidi nucleici

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un metodo per la politrasfezione inversa di cellule staminali embrionali di topo durante la coltura con terreni 2i e LIF. Questo metodo offre una maggiore fattibilità ed efficienza rispetto ai tradizionali protocolli di trasfezione diretta, consentendo al contempo l'ottimizzazione one-pot dei rapporti plasmidici.

Abstract

Grazie alla sua relativa semplicità e facilità d'uso, la trasfezione transitoria di linee cellulari di mammifero con acidi nucleici è diventata un pilastro della ricerca biomedica. Sebbene le linee cellulari più utilizzate dispongano di protocolli robusti per la trasfezione in coltura bidimensionale aderente, questi protocolli spesso non si traducono bene in linee meno studiate o con morfologie atipiche e difficili da trasfettare. Utilizzando cellule staminali pluripotenti di topo coltivate in terreni 2i/LIF, un modello di coltura ampiamente utilizzato per la medicina rigenerativa, questo metodo delinea un protocollo di trasfezione inversa rapido e ottimizzato in grado di ottenere una maggiore efficienza di trasfezione. Sfruttando questo protocollo, viene eseguita una politrasfezione a tre plasmidi, sfruttando l'efficienza superiore al normale nel rilascio di plasmidi per studiare una gamma ampliata di stechiometria plasmidico. Questo protocollo di politrasfezione inversa consente un metodo sperimentale one-pot, consentendo agli utenti di ottimizzare i rapporti plasmidici in un singolo pozzetto, piuttosto che in diverse co-trasfezioni. Facilitando la rapida esplorazione dell'effetto della stechiometria del DNA sulla funzione complessiva dei circuiti genetici consegnati, questo protocollo riduce al minimo i tempi e i costi di trasfezione delle cellule staminali embrionali.

Introduzione

La consegna di DNA e RNA nelle cellule di mammifero è un pilastro fondamentale della ricerca biomedica¹. Un metodo comune per introdurre acidi nucleici esogeni (NA) nelle cellule di mammifero è attraverso la trasfezione transitoria ^2,3. Questa tecnica si basa sulla miscelazione di NA con reagenti di trasfezione disponibili in commercio in grado di veicolarli nelle cellule riceventi. Tipicamente, la NA viene consegnata tramite trasfezione diretta, in cui le cellule aderenti a una superficie bidimensionale ricevono il complesso di trasfezione. Mentre la trasfezione in avanti per le linee cellulari consolidate più comuni è robusta e i protocolli sono ben pubblicati, i tipi di cellule più di nicchia con morfologie non monostrato non si trasfettano facilmente, limitando la quantità di NA che può essere rilasciata e il numero di cellule che la ricevono.

Le cellule staminali pluripotenti (PSC) fungono da modello interessante per la comprensione dello sviluppo e come strumento per la medicina rigenerativa, data la loro capacità di dividersi indefinitamente e produrre qualsiasi tipo di cellula corporea. Per le PSC di topo (mPSC), le condizioni di coltura in vitro di routine con 2 inibitori e LIF (2i/LIF) mantengono una morfologia della colonia simile a quella di una cupola, limitando direttamente il numero di cellule esposte a una trasfezione diretta ^4,5,6. Per risolvere questo problema, è possibile eseguire una trasfezione inversa: le cellule vengono aggiunte a un piatto contenente terreno e reagente di trasfezione, piuttosto che aggiungere il reagente di trasfezione alle cellule aderenti⁷. Se da un lato questo aumenta il numero di cellule esposte al reagente, dall'altro richiede che le cellule vengano passate e trasfettate contemporaneamente.

Andando oltre le semplici trasfezioni di NA singole, i ricercatori spesso mirano a fornire diversi costrutti NA in una popolazione di cellule in vitro. Ciò si ottiene tipicamente attraverso una co-trasfezione, in cui le NA vengono miscelate in un dato rapporto (1:1, 9:1, ecc.) e vengono quindi combinate con il reagente di trasfezione^{scelto 8}. In questo modo si ottiene una miscela di NA e reagenti che preserva il rapporto originale di NA l'una con l'altra - mentre le cellule nel trattamento possono ricevere quantità diverse di questa miscela, ricevono tutte lo stesso rapporto⁹. Sebbene ciò sia vantaggioso quando si conosce il rapporto desiderato tra le parti, la determinazione anticipata di questo rapporto può richiedere molto lavoro, poiché ogni rapporto costituisce una condizione diversa. Un'alternativa è quella di eseguire una "politrasfezione", in cui i singoli NA vengono miscelati con il reagente di trasfezione indipendentemente l'uno dall'altro⁹. Combinando complessi di trasfezione contenenti singole NA (piuttosto che combinare NA prima di creare i complessi), i ricercatori possono esplorare un'ampia gamma di stechiometrie NA in un singolo esperimento di trasfezione⁹. Ciò è particolarmente utile nei casi in cui ci si aspetta che i prodotti di diversi NA interagiscano tra loro, come ad esempio con sistemi di trascrizione inducibili o sistemi con feedback incorporato in ^1,10,11. Tuttavia, per farlo in modo efficace, è necessaria un'elevata efficienza di trasfezione. Infatti, all'aumentare del numero di NA trasfettate uniche, la probabilità che una data cellula riceva tutte le NA desiderate diminuisce esponenzialmente ^9,12.

Il seguente rapporto descrive un protocollo di trasfezione inversa per mPSC che utilizza un reagente di trasfezione a base di lipidi cationici, in cui le cellule sono esposte alla miscela reagente-NA per un massimo di 5 minuti per massimizzare la vitalità e ridurre al minimo il tempo al di fuori delle tipiche condizioni di coltura. Il confronto di questo protocollo con la trasfezione in avanti standard di queste cellule dimostra una maggiore efficienza di trasfezione e un aumento del numero totale di cellule trasfettate sopravvissute. Combinando questa trasfezione inversa con una politrasfezione a tre plasmidi che coinvolge semplici reporter fluorescenti, viene dimostrato un potenziale ampliato per lo screening dei rapporti NA con un'elevata efficienza di trasfezione.

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Protocollo

1. Preparazione di reagenti per la coltura di mPSC

1. Preparare l'integratore N2.
   1. In condizioni non sterili, preparare le seguenti soluzioni madre (fase 1.1.1.1) in una cappa di sicurezza chimica. Aggiungere la polvere solida di ciascuna sostanza chimica in una provetta conica da 50 ml prepesata. Pesare ogni provetta dopo aver aggiunto la polvere e aggiungere una quantità appropriata di solvente per ottenere le concentrazioni seguenti. Per un lotto di supporti, preparare la quantità minima indicata.
      NOTA: I seguenti reagenti sono pericolosi e devono essere maneggiati in conformità con le linee guida locali sulla sicurezza chimica. Garantire DPI adeguati durante la manipolazione e lavorare solo con le forme solide in polvere di queste sostanze chimiche in una cappa chimica per evitare l'inalazione.
      1. Almeno 0,05 mL di selenito di sodio in acqua a 0,518 mg/mL, 0,5 mL di putrescina in acqua a 160 mg/mL, 0,165 mL di progesterone in etanolo al 100% a 0,6 mg/mL (vedi Tabella dei materiali).
      2. Conservare le soluzioni a -20 °C per un massimo di 2 anni.
   2. In una cabina di biosicurezza (BSC), aggiungere quanto segue a 58,035 mL di DMEM-F12.
      1. 0,05 mL di una soluzione di selenito di sodio 0,518 mg/mL, 0,5 mL di una soluzione di putrescina 160 mg/mL, 0,165 mL di una soluzione di progesterone 0,6 mg/mL.
      2. Filtro: sterilizzare la miscela di cui sopra con un filtro da 0,22 μm.
   3. Sempre nel BSC, preparare una soluzione da 100 mg/mL di apotransferrina.
      1. Aggiungere 5 mL di DMEM-F12 a 500 mg di apotransferrina (vedere la tabella dei materiali). Risospendere e lavare lentamente il contenitore, evitando la formazione di bolle.
      2. Dopo aver risospeso e rimosso il più possibile con 5 ml, aggiungerlo alla soluzione di selenite/putrescina/progesterone. Prendi più della soluzione precedente e lava il flacone di apotransferrina, facendone uscire il più possibile.
   4. Aggiungere 5 mL di frazione V di BSA al 7,5% (vedere la tabella dei materiali) alla soluzione.
   5. Miscelare e aliquotare 6,875 mL per provetta. Conservare le aliquote a -80 °C per un massimo di 1 anno.
   6. Quando si utilizzano le aliquote N2 di cui sopra per produrre terreni N2B27, scongelare l'aliquota desiderata e aggiungere 3,125 mL di una soluzione di insulina 4 mg/mL (vedere la tabella dei materiali) ai 6,875 N2 per 10 mL di 100x N2.
2. Preparare il terreno basale N2B27.
   1. Scongelare gli integratori di N2 e B27 in frigorifero a 4 °C per alcune ore o per tutta la notte.
   2. In un BSC, mescolare 484,5 mL di DMEM-F12 e 484,5 mL di terreno neurobasale (vedere la tabella dei materiali) in un flacone sterile da 1 L.
   3. Aggiungere 10 mL di B27 e 10 mL di integratore di N2 al terreno.
   4. Aggiungere 1 mL di beta-mercaptoetanolo 55 mM (vedere la tabella dei materiali). Aggiungere 10 ml di glutamax 100x. Mescolare energicamente facendo roteare la bottiglia.
   5. Aliquotare il volume desiderato per aliquota (tipicamente 100 ml) e conservare a -80 °C per un massimo di 1 anno. Conservare in uso dopo lo scongelamento a 4 °C per un massimo di 3 settimane.
3. Preparare i supporti NBiL.
   1. Scongelare un'aliquota di 100 mL di terreno basale N2B27 a -80 °C nel frigorifero a 4 °C.
   2. In un BSC, aggiungere LIF (vedi Tabella dei materiali) a una concentrazione finale di 10 μg/L.
   3. Aggiungere CHIR99021 (3 μM finali) e PD0325901 (1 μM finale) (vedi Tabella dei materiali). Miscelare bene con una pipetta sierologica da 50 ml. Conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
4. Preparare una soluzione di gelatina allo 0,2%.
   1. Trasferire 500 mL di H₂O bidistillato in una bottiglia di vetro da 1 L.
   2. Misurare 1 g di gelatina (vedi tabella dei materiali) e aggiungerla all'acqua. Mescolare agitando il flacone fino a quando non si sarà sciolto in gran parte.
   3. Autoclavare la miscela di gelatina e acqua a 15 psi, 121 °C per 35 min. Una volta raffreddato, sterilizzarlo con un filtro da 0,22 μm in un BSC. Conservare a 4 °C.
5. Preparare i supporti di lavaggio.
   1. In un BSC, miscelare 160 μL di BSA al 7,5% per 10 mL di DMEM-F12.
   2. Ridimensionare quanto sopra e preparare in grandi quantità per facilitare l'uso futuro (ad es. da 8 mL di BSA al 7,5% a 500 mL di DMEM-F12). Conservare a 4 °C.

2. Preparazione di reagenti per la politrasfezione di mPSC

NOTA: I seguenti valori sono forniti per un singolo pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. I valori possono essere scalati di conseguenza. Le sequenze di tutti i DNA/plasmidi sono dettagliate nel File Supplementare 1.

1. Calcolare il volume di soluzione di DNA necessario per ogni trattamento.
   1. Preparare 500 ng di DNA per pozzetto/condizione.
      1. Se si trasfetta un singolo plasmide con una soluzione di DNA di 100 ng/μL, preparare una provetta con 5 μL di DNA.
      2. Se si trasfettano due plasmidi a 100 ng/μL ciascuno, preparare due provette da 2,5 μL ciascuna, una per ciascun plasmide.
2. In un BSC, eseguire quanto segue: Per ogni trattamento di trasfezione di 500 ng (vedere la tabella dei materiali), aliquotare 25 μL di OptiMEM in una provetta da 1,5 mL.
   1. Scala di conseguenza: per l'esempio sopra, prepara due provette, ciascuna con 250 ng di DNA (2,5 μL) e 12,5 μL di OptiMEM.
3. Aggiungere il volume di DNA richiesto per quel trattamento all'OptiMEM nella provetta.
4. Per ogni provetta con 500 ng di DNA e OptiMEM, creare una provetta corrispondente con altri 25 μL di OptiMEM e 1 μL di reagente di trasfezione a base di lipidi cationici.
   1. Anche in questo caso, questi valori devono essere scalati di conseguenza. Per l'esempio precedente, preparare due provette, ciascuna con 12,5 μL di OptiMEM e 0,5 μL di reagente di trasfezione.
      NOTA: Quando si scalano i valori, utilizzare la massa di DNA aggiunta, non il volume richiesto per quella quantità di DNA. Le reazioni con il reagente di trasfezione e il DNA possono essere scalate (ad esempio, se devono essere trasfettati 5 pozzetti con lo stesso DNA). Mantenere invariati i rapporti dei reagenti, ma scalare di conseguenza (ad esempio, DNA da 1000 ng: 50 μL OptiMEM: 2 μL reagente di trasfezione: 50 μL OptiMEM).

3. Preparazione delle mPSC per la trasfezione

NOTA: Per la trasfezione inversa, preparare il recipiente di coltura e far passare direttamente le mPSC prima di aggiungere i reagenti di trasfezione. Per la trasfezione in avanti, il passaggio e la placcatura delle cellule 12-18 ore prima della trasfezione per consentire alle cellule di aderire alla piastra.

1. Preparare un recipiente per colture cellulari rivestito di gelatina allo 0,2%.
   1. Pianificare il numero di pozzetti necessari per la trasfezione (un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti per trattamento/gruppo).
   2. Aggiungere 200 μL della soluzione di gelatina allo 0,2% in ciascuno dei pozzetti desiderati nella piastra a 24 pozzetti.
   3. Agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente la soluzione, assicurandosi che copra l'intero fondo del pozzetto.
   4. Lasciare rivestire i pozzetti per almeno 15 minuti a temperatura ambiente.
   5. Utilizzando un aspiratore sottovuoto, rimuovere con cura la gelatina residua dai pozzetti (inclinare la piastra per garantire la rimozione di tutto il liquido senza raschiare via lo strato di gelatina).
   6. Aggiungere 0,5 mL di terreno NBiL (passaggio 1.3) a ciascun pozzetto e lasciare la piastra in un incubatore per colture tissutali per il preriscaldamento.
2. Passaggio mPSC.
   1. Versare 30 mL di terreno di lavaggio (passaggio 1.5) in una provetta conica da 50 mL.
   2. Aspirare il vecchio terreno dalla piastra di coltura tissutale delle mESC.
      NOTA: Sono consentite diverse tecniche di aspirazione. Qualunque sia la tecnica scelta, assicurarsi che le cellule non rimangano asciutte per lunghi periodi (circa 30 s al massimo).
   3. Aggiungere la quantità necessaria di terreno di distacco cellulare disponibile in commercio (1,5 mL per un piatto da 10 cm, scala di conseguenza, vedere la tabella dei materiali).
   4. Attendere 3-5 minuti prima di pipettare su e giù 15-20 volte con una pipetta P1000 per ottenere una sospensione a cellula singola. Visualizzare le cellule al microscopio per garantire una sospensione a cellula singola.
   5. Trasferire le cellule nel mezzo di distacco nella provetta da 50 mL contenente il terreno di lavaggio.
   6. Centrifugare a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il materiale di lavaggio, assicurandosi che non rimangano residui di liquido nel tubo.
   7. Risospendere il pellet in un piccolo volume di terreno di lavaggio (~300 μL). Contare la sospensione cellulare utilizzando un emocitometro per ottenere la densità cellulare.

4. Trasfezione inversa di mPSC

1. Preparare i reagenti di politrasfezione secondo il passaggio 2.
2. Preparare il recipiente di coltura cellulare e le mPSC di passaggio secondo il passaggio 3.
3. Aliquotare 200 μL di terreno NBiL in provette da 1,5 mL, una per ogni trattamento.
4. Aggiungere 26 μL della miscela di reagenti OptiMEM:trasfezione alla miscela DNA:OptiMEM. Miscelare i reagenti rapidamente e vigorosamente pipettando circa 10 volte. Lasciare incubare la miscela a temperatura ambiente per 5 minuti.
5. In base alla densità cellulare, trasferire il volume richiesto di cellule dalla sospensione cellulare da 300 μL alle provette NBiL da 200 μL per ottenere 25.000 cellule per provetta.
6. Dopo 5 minuti di incubazione della miscela di Lipofectamine 2000 (L2K, reagente di trasfezione) e DNA, aggiungerla alla provetta da 1,5 mL di cellule e mescolare bene pipettando. Lasciare incubare le cellule con il reagente per 5 minuti a temperatura ambiente.
7. Centrifugare a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente. Pipettare il liquido, lasciando circa 50 μL.
8. Risospendere il pellet cellulare con 100 μL di terreno NBiL. Trasferire le cellule sulla piastra e posizionare la piastra nell'incubatrice. Sostituire il supporto 24 ore dopo con un nuovo supporto NBiL.

5. Trasfezione a termine di mPSC

1. 12-18 ore prima della trasfezione, preparare il recipiente di coltura cellulare e far passare le mPSC secondo il passaggio 3.
2. In base alla densità cellulare, trasferire il volume richiesto di cellule dalla miscela di cellule da 300 μL a seminare 25.000 cellule per pozzetto. Posizionare la piastra nell'incubatrice.
3. 1 ora prima della trasfezione, aspirare il terreno da tutti i pozzetti e sostituirlo con 0,5 mL di terreno NBiL. Posizionare la piastra nell'incubatrice.
4. Al momento della trasfezione, preparare i reagenti di politrasfezione mPSC secondo la fase 2.
5. Aggiungere 26 μL della miscela di reagenti OptiMEM:trasfezione alla miscela DNA:OptiMEM. Miscelare i reagenti rapidamente e vigorosamente pipettando circa 10 volte. Lasciare incubare la miscela combinata a temperatura ambiente per 5 minuti.
6. Aggiungere la miscela combinata ai pozzetti goccia a goccia. Posizionare la piastra nell'incubatrice. Sostituire il supporto 24 ore dopo.

6. Citometria a flusso

1. Aspirare il terreno dalla piastra a 24 pozzetti trasfettata 48 ore dopo la trasfezione.
2. Aggiungere 200 μL di tripsina a ciascun pozzetto, agitare e incubare per 30 s a 37 °C. Picchiettare i lati della piastra e aggiungere 200 μL di tampone FACS ghiacciato (2% FBS in PBS).
3. Aprire ed etichettare una piastra a 96 pozzetti con fondo a V, partendo da A1. Miscelare il contenuto di ciascun pozzetto sulla piastra trasfettata per rimuovere le cellule e creare soluzioni a cellula singola con una pipetta P200. Trasferire 200 μL da ciascun pozzetto al pozzetto appropriato sulla piastra a 96 pozzetti.
4. Aggiungere 15 mL di tampone FACS a un serbatoio di reagenti da 50 mL. Centrifugare la piastra a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante capovolgendo la piastra a 96 pozzetti nel lavandino con un movimento rapido e fluido.
5. Utilizzare una pipetta multicanale per risospendere i pellet sulla piastra a 96 pozzetti in 150 μL di tampone FACS dal serbatoio del reagente. Ripetere due volte i passaggi 6.4-6.5. Posizionare la piastra a 96 pozzetti in una scatola piena di ghiaccio al riparo dalla luce.
6. Far passare i campioni attraverso un citometro a flusso per ottenere la distribuzione della popolazione dei reporter fluorescenti.
   1. Assicurarsi che il citometro sia appropriato in termini di combinazioni di laser e filtro per l'esperimento da eseguire (ad esempio, non utilizzare un reporter a infrarossi se non è possibile eccitare o rilevare nello spettro del rosso lontano).
   2. Includere campioni aggiuntivi per le perle di standardizzazione per consentire la conversione MEFL dei dati durante l'analisi. Assicurarsi che venga raccolto un numero sufficiente di cellule per campione per un'analisi statistica appropriata⁹.
7. Converti le unità fluorescenti dai file del citometro grezzo e analizza i dati utilizzando uno dei diversi metodi, come pipeline basate su Python o MATLAB o software disponibili in commercio ^9,13.

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Risultati

Sia le trasfezioni dirette che quelle inverse si basano sull'interazione tra la membrana cellulare e i complessi reagente-DNA di trasfezione in entrata, consentendo la consegna di NA alle cellule riceventi. Dove queste tecniche differiscono è lo stato della cellula al momento della consegna: mentre il DNA viene tipicamente consegnato a monostrati di cellule aderenti nella tradizionale trasfezione diretta, la trasfezione inversa si basa invece sul fatto che il complesso reagente-DNA incontra le cellule mentre si trova in...

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Discussione

Una delle ragioni principali per l'adozione diffusa dei protocolli di trasfezione è la loro riproducibilità e accessibilità; Tuttavia, questi protocolli richiedono l'ottimizzazione in contesti sperimentali. Non menzionato sopra è il test standard richiesto quando si tenta di trasfettare una nuova linea cellulare per la prima volta. In primo luogo, la scelta del reagente di trasfezione è fondamentale, poiché i reagenti disponibili in commercio non sono uguali per tutti e variano nell'efficienza della vitalità della...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrin	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044
Beta-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	21985023
BSA fraction V (7.5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beads	Spherotech	URCP-38-2K
Gelatin	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Insulin	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent
Neurobasal media	ThermoFisher Scientific	21103049
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesterone	MilliporeSigma	P8783	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Sodium selenite	MilliporeSigma	S5261-25G	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200056