نهج شامل لتحليل مكونات الخلايا من جلطات الدم الدماغية

Summary

تصف هذه الدراسة طريقة سريعة وفعالة لتحليل مكونات الخلية للجلطات الدموية الدماغية من خلال إذابة الجلطة وتلطيخ الخلايا وفحص الدم الروتيني.

Abstract

الجلطة الدماغية ، وهي جلطة دموية في الشريان أو الوريد الدماغي ، هي أكثر أنواع الاحتشاء الدماغي شيوعا. دراسة مكونات الخلية من جلطات الدم الدماغية مهمة للتشخيص والعلاج والتشخيص. ومع ذلك ، فإن الأساليب الحالية لدراسة مكونات الخلية في الجلطات تعتمد بشكل أساسي على التلوين في الموقع ، وهو أمر غير مناسب للدراسة الشاملة لمكونات الخلية لأن الخلايا ملفوفة بإحكام في الجلطات. نجحت الدراسات السابقة في عزل إنزيم محلل للفبرين (sFE) من Sipunculus nudus ، والذي يمكن أن يؤدي إلى تحلل الفيبرين المتصالب مباشرة ، وإطلاق مكونات الخلية. أنشأت هذه الدراسة طريقة شاملة تعتمد على sFE لدراسة مكونات الخلية في الخثرة الدماغية. يتضمن هذا البروتوكول إذابة الجلطة ، وإطلاق الخلايا ، وتلطيخ الخلايا ، وفحص الدم الروتيني. وفقا لهذه الطريقة ، يمكن دراسة مكونات الخلية كميا ونوعيا. يتم عرض النتائج التمثيلية للتجارب باستخدام هذه الطريقة.

Introduction

الأمراض الدماغية الوعائية هي واحدة من ثلاثة أمراض رئيسية يمكن أن تهدد صحة الإنسان ، من بينها الأمراض الدماغية الوعائية التي تمثل أكثر من 80 ٪. تجلط الدم الدماغي وتجلط الأوردة الدماغية هي أكثر الأمراض الدماغية الوعائية الإقفارية اليوم ، والتي تسببها بشكل رئيسي جلطات الدم الدماغية ^1,2. إذا لم يتم العلاج بشكل صحيح ، فسيكون له معدلات عالية من الإعاقة والوفيات ومعدل تكرار مرتفع بعد الخروج³.

في الآونة الأخيرة ، أظهر عدد متزايد من الدراسات أن مكونات الخلايا في جلطات الدم الدماغية ترتبط ارتباطا وثيقا بتشخيص وعلاج وتشخيص تجلط الدم الدماغي^4،5،6. لذلك ، فإن توافر البيانات حول تكوين الجلطة ، وخاصة مكونات الخلية ، مهم للتشخيص والعلاج السريري. لسوء الحظ ، لا يمكن للطرق المتاحة حاليا تحليل مكون جلطة الدم بشكل شامل كميا ونوعيا. على سبيل المثال ، يمكن للتلطيخ في الموقع القائم على Martius Scarlett Blue فقط دراسة خلايا الدم الحمراء / البيضاء لشرائح معينة من الجلطة⁷. يمكن للتلوين في الموقع القائم على الكيمياء المناعية (IHC) دراسة مكونات الدم المحدودة لشرائح معينة من الجلطة باستخدام أجسامها^{المضادة 8}. تهتم الطرق المجهرية القائمة على الصور فقط بالبنية المحددة للجلطة⁹. علاوة على ذلك ، كل هذه الأساليب شاقة وتستغرق وقتا^{طويلا 10}. حتى الآن ، لم يتم الإبلاغ عن إجراءات دراسة مكونات خلايا الجلطات الدماغية كميا ونوعيا. من المسلم به على نطاق واسع أن الفيبرين المتصالب يلف خلايا الدم بإحكام في الجلطات¹¹. وبالتالي ، فإن التدهور المحدد للفيبرين المتصالب وإطلاق الخلايا السليمة أمر بالغ الأهمية للتحليل الدقيق لمكونات الخلية.

قامت الأعمال السابقة بعزل إنزيم محلل للفبرين من Sipunculus nudus (sFE) ، والذي يمكن أن يتحلل الفيبرين على وجه التحديد وبسرعة¹². هنا ، تم اقتراح طريقة لتحليل مكونات الخلية للجلطات الدماغية بناء على النشاط الفريد ل sFE. استخدم هذا البروتوكول sFE لتحلل الفيبرين من الجلطات أولا ثم تحليل مكونات الخلية عن طريق تلطيخ رايت وفحص الدم^{الروتيني 13،14}. وفقا لهذه الطريقة ، يمكن دراسة مكونات الخلية من الجلطات الدموية الدماغية كميا ونوعيا. يمكن تطبيق هذا البروتوكول البسيط والفعال لتحليل مكونات الخلية للجلطات الدموية الأخرى.

Protocol

تم إجراء البحث وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للجنة الأخلاقيات الطبية بجامعة هواتشياو. تمت إزالة جلطات الدم الدماغية جراحيا وجمعها في مستشفى تشيوانتشو الأول ، التابع لجامعة فوجيان الطبية ، بموافقة مستنيرة من المرضى.

1. المعالجة المسبقة لجلطة الدم

1. ضع الجلطات على طبق نظيف ، أضف 5 مل من المحلول الملحي الفسيولوجي مع ملقط ، هز الطبق برفق ، وأزل المحلول الملحي باستخدام ماصة.
   ملاحظة: كرر الشطف ثلاث مرات.
2. قطع الجلطات إلى قطع أصغر (أصغر من 5 مم × 5 مم × 5 مم) بمقص. أضف 5 مل من المحلول الملحي الفسيولوجي ، وهز الطبق برفق ، وأزل المحلول الملحي باستخدام ماصة.
   ملاحظة: كرر الشطف ثلاث مرات. تأكد من عدم شفط قطع الجلطة أثناء الشطف.
3. انقل الجلطات إلى لوحة U نظيفة أخرى.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا (قم بتخزين اللوحة عند 2-8 درجة مئوية) وإعادة تشغيلها لاحقا.

2. انحلال الخثرة

1. تحضير محلول عمل sFE عن طريق ضبط تركيز sFE إلى 2000 وحدة / مل مع محلول ملحي فسيولوجي.
   ملاحظة: تم إعداد sFE وفقا للبروتوكولات الراسخة لمختبر تانغ¹⁵.
2. أضف 300 ميكرولتر من محلول عمل sFE في الجلطات المعالجة مسبقا.
3. أداء الجولة الأولى من التدهور.
   1. احتضان خليط sFE والجلطات عند 37 درجة مئوية لمدة 0.5 ساعة.
      ملاحظة: تم تعيين اللطخة المعالجة بالمحلول الملحي الفسيولوجي كتحكم سلبي. لا تقم بتدوير العينة على الخفق.
   2. امزج العينة برفق. انقل الجزء السائل إلى أنبوب نظيف آخر باستخدام ماصة نظيفة.
      ملاحظة: تم استخدام الجلطات المتبقية لجولة أخرى من التحلل.
   3. جهاز طرد مركزي الجزء السائل عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   4. انقل المادة الطافية إلى أنبوب نظيف آخر باستخدام ماصة للحصول على محلول sFE المسترد.
   5. امزج ترسيب الخلية مع 50 ميكرولتر من المحلول الملحي الفسيولوجي بلطف.
      ملاحظة: تم تخزين خليط الخلية 2-8 درجة مئوية لاستخدامه لاحقا.
4. أداء تدهور لاحق.
   1. تحلل الجلطات المتبقية (الخطوة 2.3.2) باستخدام محلول sFE المستعاد (الخطوة 2.3.4) عند 37 درجة مئوية لمدة 0.5 ساعة.
      ملاحظة: كانت الخطوات المتبقية هي نفسها في جولة التحلل الأولى. تم الانتهاء من عملية التحلل حتى تدهورت الجلطات بأكملها.
5. إجراء جمع الخلايا.
   1. تحضير عينة خلايا الدم عن طريق جمع خليط الخلية من كل جولة من التدهور.

3. تلطيخ رايت

1. أداء تشويه الخلية.
   1. اضبط الخلايا على كثافة 1 × 10⁶ خلايا / مل.
   2. أضف 5 ميكرولتر من الخلايا إلى الشريحة الزجاجية المطلية بالليسين poly-L ، ثم قم بتلطيخها باستخدام قسيمة الغطاء.
   3. تتبخر السائل في درجة حرارة الغرفة.
2. أداء تلطيخ.
   1. أضف 200 ميكرولتر من صبغة رايت (انظر جدول المواد) إلى مسحة الخلية برفق ، وأضف 600 ميكرولتر من صبغة رايت B لخلطها بالتساوي.  صمة عار لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   2. اشطف الصبغة برفق بالماء النظيف.
      ملاحظة: يمكن تخزين مسحة الخلايا الملطخة في درجة حرارة الغرفة لاستخدامها لاحقا.
3. أداء التصوير المجهري.
   1. افحص الخلايا الملطخة باستخدام مجهر ضوئي (انظر جدول المواد).

4. فحص الدم الروتيني

1. اضبط الخلايا على كثافة 1 × 10⁶ خلايا / مل.
2. تحليل مكونات الخلية مثل الصفائح الدموية ، كريات الدم الحمراء ، خلايا الدم البيضاء ، الخلايا الليمفاوية ، العدلات ، الوحيدات ، الحمضات ، الخلايا القاعدية ، والخلايا المحببة غير الناضجة باستخدام محلل أمراض الدم الذاتية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).

النتائج

في المرحلة الأولى من عملية التحلل ، وجد أن جلطات الدم لها بنية مدمجة حمراء ، وأن محلول العمل كان عديم اللون. بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة ، تحول محلول العمل إلى اللون الأحمر الفاتح ، مما يشير إلى إطلاق خلايا الدم المتقاطعة في محلول العمل. تم إذابة معظم الجلطات عند إطالة وقت الحضانة إلى 5 ساعات ، ?...

Discussion

sFE هو عامل تحلل الفيبرين الذي يمكن أن يحلل الفيبرين مباشرة وفعالية^12,16. هنا ، تم استخدام sFE لتحلل الفيبرين المتصالب للجلطات الدموية الدماغية ، وإطلاق الخلايا المغلقة داخل الجلطات ، وتحليل مكونات الخلية للجلطات نوعيا وكميا. أشارت بيانات الفحص المجهري وفحص ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agglutination Reaction Plate	ROTEST	RTB-4003
Auto Hematology Analyzer	SYSMEX	XNB2
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer	SANYO	MLS-3750
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Clean bench	AIRTECH	BLB-1600
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Culture Dish (100 mm)	NEST	704001
DHG Series Heating and Drying Oven	SENXIN	DGG-9140AD
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP	SLGP033NK
Micro Refrigerated Centrifuge	Cence	H1650-W
Microscope Slides	CITOGLAS	01-30253-50
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Normal Saline	CISEN	H37022337
Optical Microscope	Nikon	ECLIPSE E100
Parafilm	Bemis	PM-996
Phosphate-Buffered Saline	Beyotime	C0221A
Pipette Tip (1 mL )	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Scalpel	MARTOR	23111
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell	VORTEX KB3
Tweezer	Hystic	HKQS-180
Wright Staining Solution	Beyotime	C0135-500ml