Uma abordagem abrangente para analisar os componentes celulares de coágulos sanguíneos cerebrais

Resumo

Este estudo descreve um método rápido e eficaz para a análise de componentes celulares de coágulos sanguíneos cerebrais através da dissolução de coágulos, coloração celular e exame de sangue de rotina.

Resumo

A trombose cerebral, um coágulo sanguíneo em uma artéria ou veia cerebral, é o tipo mais comum de infarto cerebral. O estudo dos componentes celulares dos coágulos sanguíneos cerebrais é importante para o diagnóstico, tratamento e prognóstico. No entanto, as abordagens atuais para estudar os componentes celulares dos coágulos são baseadas principalmente na coloração in situ , o que é inadequado para o estudo abrangente dos componentes celulares porque as células estão firmemente envolvidas nos coágulos. Estudos anteriores conseguiram isolar uma enzima fibrinolítica (FEs) de Sipunculus nudus, que pode degradar diretamente a fibrina reticulada, liberando os componentes celulares. Este estudo estabeleceu um método abrangente baseado na FEF para estudar os componentes celulares do trombo cerebral. Esse protocolo inclui dissolução de coágulos, liberação de células, coloração de células e exame de sangue de rotina. De acordo com esse método, os componentes celulares puderam ser estudados quantitativa e qualitativamente. Os resultados representativos dos experimentos que utilizam este método são mostrados.

Introdução

A doença cerebrovascular é uma das três principais doenças que podem ameaçar a saúde humana, dentre as quais a doença cerebrovascular isquêmica é responsável por mais de 80%. A trombose cerebral e a trombose venosa cerebral são as doenças isquêmicas cerebrovasculares mais afetadas na atualidade, causadas principalmente por coágulos sanguíneos^cerebrais1,2. Se o tratamento não for feito adequadamente, terá altas taxas de incapacidade e mortalidade e alta taxa de recorrência após a alta^hospitalar3.

Recentemente, um número crescente de estudos tem demonstrado que os componentes celulares dos coágulos sanguíneos cerebrais estão estreitamente correlacionados com o diagnóstico, tratamento e prognóstico da trombose^{cerebral4,5,6}. Portanto, a disponibilidade de dados sobre a composição do trombo, especialmente os componentes celulares, é importante para o diagnóstico clínico e tratamento. Infelizmente, os métodos atualmente disponíveis não podem analisar quantitativa e qualitativamente o componente do coágulo sanguíneo. Por exemplo, a coloração in situ baseada em Martius Scarlett Blue só pode estudar os glóbulos vermelhos/brancos de certas fatias do coágulo⁷. A coloração in situ baseada em imuno-histoquímica (IHQ) só pode estudar componentes sanguíneos limitados de certos cortes do coágulo usando seus anticorpos⁸. Os métodos microscópicos baseados em imagens preocupam-se apenas com a estrutura específica do coágulo⁹. Além disso, todos esses métodos são trabalhosos e demorados¹⁰. Até o momento, os procedimentos para estudo quantitativo e qualitativo dos componentes das células dos trombos cerebrais não foram relatados. É amplamente reconhecido que a fibrina reticulada envolve firmemente as células sanguíneas nos coágulos¹¹. Consequentemente, a degradação específica da fibrina reticulada e a liberação das células intactas são críticas para a análise precisa dos componentes celulares.

Trabalhos anteriores isolaram uma enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (sFE), que pode degradar a fibrina específica e rapidamente¹². Neste trabalho, foi proposto um método para analisar os componentes celulares dos trombos cerebrais baseado na atividade única da FEs. Esse protocolo utilizou o FE para degradar primeiramente a fibrina dos coágulos e, em seguida, analisou os componentes celulares pela coloração de Wright e exame de sangue de rotina^13,14. De acordo com esse método, os componentes celulares dos trombos cerebrais podem ser estudados quantitativa e qualitativamente. Este protocolo simples e eficaz pode ser aplicado para a análise de componentes celulares de outros coágulos sanguíneos.

Protocolo

A pesquisa foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais do Comitê de Ética Médica da Universidade de Huaqiao. Os coágulos sanguíneos cerebrais foram removidos cirurgicamente e coletados no Quanzhou First Hospital, afiliado à Fujian Medical University, com consentimento informado dos pacientes.

1. Pré-tratamento do coágulo sanguíneo

1. Coloque os coágulos em um prato limpo, adicione 5 mL de soro fisiológico com um tweezer, agite o prato suavemente e retire o soro fisiológico com uma pipeta.
   NOTA: Repita o enxágue três vezes.
2. Corte os coágulos em pedaços menores (menores que 5 mm x 5 mm x 5 mm) com uma tesoura. Adicione 5 mL de soro fisiológico, agite o prato suavemente e retire o soro fisiológico com uma pipeta.
   NOTA: Repita o enxágue três vezes. Certifique-se de que nenhum pedaço de coágulo seja aspirado durante o enxágue.
3. Transfira os coágulos para outra placa em U limpa.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui (armazenar a placa a 2-8 °C) e reiniciado mais tarde.

2. Trombólise

1. Preparar a solução de trabalho de sFE ajustando a concentração de sFE para 2000 U/mL com soro fisiológico.
   NOTA: A FE foi preparada de acordo com os protocolos bem estabelecidos do Tang Lab¹⁵.
2. Adicionar 300 μL de solução de trabalho de sFE aos coágulos pré-tratados.
3. Realizar a primeira rodada de degradação.
   1. Incubar a mistura de sFE e coágulos a 37 °C durante 0,5 h.
      OBS: O blot tratado com soro fisiológico foi definido como controle negativo. Não gire a amostra no agitador.
   2. Misture a amostra delicadamente. Transfira a parte líquida para outro tubo limpo com uma pipeta limpa.
      NOTA: Os coágulos restantes foram usados para outra rodada de degradação.
   3. Centrifugar a parte líquida a 200 × g durante 5 min a 4 °C.
   4. Transfira o sobrenadante para outro tubo limpo com uma pipeta para obter a solução de sFE recuperada.
   5. Misture suavemente a precipitação celular com 50 μL de solução salina fisiológica.
      NOTA: A mistura celular foi armazenada a 2-8 °C para uso posterior.
4. Executar a degradação subsequente.
   1. Degradar os coágulos restantes (passo 2.3.2) com a solução de sFE recuperada (passo 2.3.4) a 37 °C durante 0,5 horas.
      NOTA: As etapas de descanso foram as mesmas da primeira rodada de degradação. O processo de degradação foi finalizado até que todos os coágulos fossem degradados.
5. Executar a coleta de células.
   1. Preparar a amostra de células sanguíneas coletando a mistura celular de cada rodada de degradação.

3. Coloração de Wright

1. Realizar esfregaço celular.
   1. Ajustar as células a uma densidade de 1 x 10⁶ células/mL.
   2. Adicione 5 μL das células à lâmina de vidro revestida de lisina poli-L e, em seguida, esfregue-as usando a folha de cobertura.
   3. Evaporar o líquido à temperatura ambiente.
2. Realizar a coloração.
   1. Adicione 200 μL do corante de Wright (ver Tabela de Materiais) ao esfregaço celular suavemente e adicione 600 μL do corante B de Wright para misturar uniformemente.  Manchar por 10 min em temperatura ambiente.
   2. Enxágue o corante suavemente com água limpa.
      NOTA: O esfregaço celular corado pode ser armazenado à temperatura ambiente para uso posterior.
3. Realizar imagens microscópicas.
   1. Examine as células coradas usando um microscópio de luz (ver Tabela de Materiais).

4. Exame de sangue de rotina

1. Ajustar as células a uma densidade de 1 x 10⁶ células/mL.
2. Analise os componentes celulares como plaquetas, eritrócitos, glóbulos brancos, linfócitos, neutrófilos, monócitos, eosinófilos, basófilos e granulócitos imaturos usando um analisador de auto-hematologia de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).

Resultados

Na fase inicial do processo de degradação, verificou-se que os coágulos sanguíneos tinham uma estrutura compacta vermelha, e a solução de trabalho era incolor. Após a incubação por 30 min, a solução de trabalho ficou vermelha clara, o que indicou que as células sanguíneas cruzadas foram liberadas na solução de trabalho. A maioria dos coágulos foi dissolvida ao prolongar o tempo de incubação para 5 h, e a solução de trabalho tornou-se vermelha clara. Ao contrário, não houve alteração significativa ...

Discussão

O FEs é um agente fibrinolítico capaz de degradar a fibrina de forma direta e eficaz^12,16. Aqui, o sFE foi empregado para degradar a fibrina reticulada dos coágulos sanguíneos cerebrais, liberar as células fechadas dentro dos coágulos e analisar qualitativa e quantitativamente os componentes celulares dos coágulos. Os dados de microscopia e o exame de sangue de rotina indicaram que as células fechadas foram liberadas dos coágulos sanguíneos. Além disso...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agglutination Reaction Plate	ROTEST	RTB-4003
Auto Hematology Analyzer	SYSMEX	XNB2
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer	SANYO	MLS-3750
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Clean bench	AIRTECH	BLB-1600
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Culture Dish (100 mm)	NEST	704001
DHG Series Heating and Drying Oven	SENXIN	DGG-9140AD
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP	SLGP033NK
Micro Refrigerated Centrifuge	Cence	H1650-W
Microscope Slides	CITOGLAS	01-30253-50
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Normal Saline	CISEN	H37022337
Optical Microscope	Nikon	ECLIPSE E100
Parafilm	Bemis	PM-996
Phosphate-Buffered Saline	Beyotime	C0221A
Pipette Tip (1 mL )	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Scalpel	MARTOR	23111
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell	VORTEX KB3
Tweezer	Hystic	HKQS-180
Wright Staining Solution	Beyotime	C0135-500ml