脳血栓の細胞成分を包括的に解析する

要約

この研究では、血栓の溶解、細胞染色、および定期的な血液検査による脳血栓の細胞成分分析のための迅速かつ効果的な方法について説明します。

要約

脳動脈や静脈に血栓ができる脳血栓症は、脳梗塞の最も一般的なタイプです。脳血栓の細胞成分の研究は、診断、治療、および予後にとって重要です。しかし、血栓の細胞成分を研究するための現在のアプローチは、主に in situ 染色に基づいており、細胞が血栓にしっかりと包まれているため、細胞成分の包括的な研究には適していません。これまでの研究では、 Sipunculus nudusから線溶酵素(sFE)を単離することに成功しており、架橋されたフィブリンを直接分解して細胞成分を放出することができます。本研究により、sFEに基づく脳血栓の細胞成分を網羅的に調べる方法を確立した。このプロトコルには、血栓溶解、細胞解放、細胞染色、および定期的な血液検査が含まれます。この方法によれば、細胞成分を定量的および定性的に研究することができる。この手法を用いた実験の代表的な結果を示す。

概要

脳血管疾患は、人間の健康を脅かす可能性のある3大疾患の1つであり、そのうち虚血性脳血管疾患は80%以上を占めています。脳血栓症と脳静脈血栓症は、主に脳血栓によって引き起こされる、今日最も懸念されている虚血性脳血管疾患です^1,2。治療が適切に行われないと、障害率や死亡率が高くなり^、退院後の再発率も高くなります3。

近年、脳血栓の細胞成分が脳血栓症の診断、治療、予後と密接な相関関係にあることを示す研究が増えています^4,5,6。したがって、血栓組成、特に細胞成分に関するデータの可用性は、臨床診断と治療にとって重要です。残念ながら、現在利用可能な方法では、血栓成分を定量的にも定性的にも包括的に分析することはできません。例えば、Martius Scarlett Blueベースのin-situ染色では^、血栓の特定のスライスの赤血球/白血球しか調べることができません7。免疫組織化学(IHC)に基づくin-situ染色では、抗体を用いて血栓の特定のスライスの限ら....

プロトコル

この研究は、華橋大学の医療倫理委員会の機関ガイドラインに準拠して行われました。脳血栓は外科的に除去され、福建医科大学附属泉州第一病院で、患者のインフォームドコンセントを得て採取された。

1.血栓の前処理

1. 血栓を清潔な皿の上に置き、ピンセットで生理食塩水5mLを加え、皿を静かに振って、ピペットで生理食塩水を取り除きます。
   注意: すすぎを3回繰り返します。
2. はさみで血栓を小さく切ります(5mm x 5mm x 5mm未満)。生理食塩水5mLを加え、皿を軽く振って、ピペットで生理食塩水を取り除きます。
   注意: すすぎを3回繰り返します。すすぎ中に血栓片が吸引されていないことを確認してください。
3. 血栓を別のきれいなUプレートに移します。
   注:プロトコルはここで一時停止し(プレートを2〜8°Cで保存)、後で再起動できます。

2.血栓溶解

1. 生理食塩水でsFEの濃度を2000 U/mLに調整して、sFEワーキング溶液を調製します。
   注:sFEは、Tang Lab¹⁵の確立されたプロトコルに従って調製されました。
2. 前処理した血栓に300μLのsFE作動溶液を加えます。

ディスカッション

sFEは、フィブリンを直接かつ効果的に分解することができる線溶剤である^12,16。ここでは、sFEを用いて、脳血栓の架橋フィブリンを分解し、血栓内の封入細胞を遊離させ、血栓の細胞成分を定性的および定量的に分析しました。顕微鏡データと定期的な血液検査により、同封された細胞が血栓から放出されたことが示されました。さらに、放出され.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agglutination Reaction Plate	ROTEST	RTB-4003
Auto Hematology Analyzer	SYSMEX	XNB2
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer	SANYO	MLS-3750
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Clean bench	AIRTECH	BLB-1600
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Culture Dish (100 mm)	NEST	704001
DHG Series Heating and Drying Oven	SENXIN	DGG-9140AD
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP	SLGP033NK
Micro Refrigerated Centrifuge	Cence	H1650-W
Microscope Slides	CITOGLAS	01-30253-50
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Normal Saline	CISEN	H37022337
Optical Microscope	Nikon	ECLIPSE E100
Parafilm	Bemis	PM-996
Phosphate-Buffered Saline	Beyotime	C0221A
Pipette Tip (1 mL )	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Scalpel	MARTOR	23111
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell	VORTEX KB3
Tweezer	Hystic	HKQS-180
Wright Staining Solution	Beyotime	C0135-500ml