一种分析脑血凝块细胞成分的综合方法

摘要

本研究描述了一种通过溶栓、细胞染色和常规血液检查对脑血凝块进行细胞成分分析的快速有效方法。

摘要

脑血栓形成是脑动脉或静脉中的血凝块，是最常见的脑梗塞类型。脑血栓细胞成分的研究对诊断、治疗和预后具有重要意义。然而，目前研究凝块细胞成分的方法主要基于 原位 染色，由于细胞被紧密包裹在凝块中，因此不适合对细胞成分进行综合研究。先前的研究已成功从 Sipunculus nudus中分离出一种纤维蛋白溶解酶（sFE），该酶可以直接降解交联的纤维蛋白，释放细胞成分。本研究建立了一种基于sFE的综合方法，用于研究脑血栓的细胞成分。该方案包括凝块溶解、细胞释放、细胞染色和常规血液检查。根据这种方法，可以对细胞成分进行定量和定性研究。显示了使用该方法的实验的代表性结果。

引言

脑血管疾病是威胁人体健康的三大疾病之一，其中缺血性脑血管疾病占80%以上。脑血栓形成和脑静脉血栓形成是当今最受关注的缺血性脑血管疾病，主要由脑血栓引起^1,2。如果治疗不当，将有很高的残疾率和死亡率，出院后复发率很高³.

最近，越来越多的研究表明，脑血栓的细胞成分与脑血栓形成的诊断、治疗和预后密切相关^4,5,6。因此，血栓组成数据的可用性，尤其是细胞成分的数据，对于临床诊断和治疗非常重要。不幸的是，目前可用的方法无法定量和定性地全面分析血凝块成分。例如，基于 Martius Scarlett Blue 的原位染色只能研究凝块⁷ 某些切片的红/白细胞。基于免疫组织化学 （IHC） 的原位染色只能使用其抗体研究凝块某些切片的有限血液成分⁸。基于显微图像的方法仅关注凝块⁹的特定结构。此外，所有这些方法都费力且耗时¹⁰.迄今为止，尚未报道定量和定性研究脑血栓细胞成分的程序。人们普遍认为，交联的纤维蛋白将血细胞紧紧包裹在凝块中¹¹.因此，交联纤维蛋白的特异性降解和完整细胞的释放对于细胞成分的准确分析至关重要。

先前的工作是从 Sipunculus nudus （sFE） 中分离出一种纤维蛋白溶解酶，它可以特异性地快速降解纤维蛋白¹²。在此，提出了一种基于sFE独特活性的脑血栓细胞成分分析方法。该方案首先利用sFE降解凝块的纤维蛋白，然后通过Wright染色和常规血液检查分析细胞成分^13,14。根据这种方法，可以对脑血栓的细胞成分进行定量和定性研究。这种简单有效的方案可用于其他血凝块的细胞成分分析。

研究方案

该研究是按照华侨大学医学伦理委员会的机构指南进行的。经患者知情同意，在福建医科大学附属泉州市第一医院手术切除并采集脑血凝块。

1.血凝块预处理

1. 将凝块放在干净的培养皿上，用镊子加入 5 mL 生理盐水，轻轻摇晃培养皿，然后用移液管除去生理盐水。
   注意： 重复冲洗三次。
2. 用剪刀将凝块切成小块（小于 5 mm x 5 mm x 5 mm）。加入 5 mL 生理盐水，轻轻摇晃培养皿，然后用移液管除去生理盐水。
   注意： 重复冲洗三次。确保在冲洗过程中没有凝块被吸入。
3. 将凝块转移到另一个干净的 U 型板上。
   注意：可以在此处暂停方案（将板储存在2-8°C）并稍后重新启动。

2. 溶栓

1. 用生理盐水将sFE浓度调节至2000U / mL来制备sFE工作溶液。
   注：sFE是根据Tang Lab¹⁵的既定方案制备的。
2. 将 300 μL sFE 工作溶液加入预处理的凝块中。
3. 执行第一轮降级。
   1. 将sFE和凝块的混合物在37°C孵育0.5小时。
      注：用生理盐水处理的印迹设置为阴性对照。不要旋转样品在摇床上。
   2. 轻轻混合样品。用干净的移液管将液体部分转移到另一个干净的管中。
      注意：剩余的凝块用于另一轮降解。
   3. 将液体部分在4°C下以200× g 离心5分钟。
   4. 用移液管将上清液转移到另一个干净的管中，以获得回收的sFE溶液。
   5. 将细胞沉淀物与 50 μL 生理盐水轻轻混合。
      注：将细胞混合物储存在2-8°C以备后用。
4. 执行后续降级。
   1. 用回收的sFE溶液（步骤2.3.4）在37°C下降解剩余的凝块（步骤2.3.2）0.5小时。
      注意：其余步骤与第一轮降级相同。降解过程完成，直到整个凝块降解。
5. 执行单元格收集。
   1. 通过收集每轮降解的细胞混合物来制备血细胞样品。

3. 赖特染色

1. 进行细胞涂片。
   1. 将细胞调节至 1 x 10⁶ 个细胞/mL 的密度。
   2. 将 5 μL 细胞加入 poly-L 赖氨酸包被的载玻片中，然后使用盖玻片涂抹它们。
   3. 在室温下蒸发液体。
2. 进行染色。
   1. 向细胞涂片中轻轻加入 200 μL Wright 染料（参见 材料表），加入 600 μL Wright 染料 B 混合均匀。 在室温下染色10分钟。
   2. 用清水轻轻冲洗染料。
      注意：染色的细胞涂片可以在室温下储存以备后用。
3. 进行显微成像。
   1. 使用光学显微镜检查染色细胞（参见 材料表）。

4.血常规检查

1. 将细胞调节至 1 x 10⁶ 个细胞/mL 的密度。
2. 根据制造商的说明，使用自体血液分析仪分析细胞成分，例如血小板，红细胞，白细胞，淋巴细胞，中性粒细胞，单核细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞和未成熟粒细胞（参见 材料表）。

结果

在降解过程的初始阶段，发现血凝块呈红色致密结构，工作溶液为无色。孵育30 min后，工作溶液变为浅红色，表明交叉的血细胞被释放到工作溶液中。当孵育时间延长至5 h时，大多数凝块溶解，工作溶液变为浅红色。相反，即使在孵育10小时后，生理盐水组（NC）也没有显着变化（图1）。这些结果表明，该方案成功释放了包裹在凝块中的血细胞。

Wright染...

讨论

sFE 是一种纤溶剂，可直接有效地降解纤维蛋白^12,16。本研究采用sFE技术降解脑血凝块的交联纤维蛋白，释放血栓内封闭的细胞，并定性和定量分析血栓的细胞成分。显微镜数据和血常规检查表明，封闭的细胞从血凝块中释放出来。此外，sFE处理后释放细胞的细胞类型和结构没有受到显着影响。因此，首次创造了一种独特、简单、有效的方法来分析脑血?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agglutination Reaction Plate	ROTEST	RTB-4003
Auto Hematology Analyzer	SYSMEX	XNB2
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer	SANYO	MLS-3750
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Clean bench	AIRTECH	BLB-1600
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Culture Dish (100 mm)	NEST	704001
DHG Series Heating and Drying Oven	SENXIN	DGG-9140AD
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP	SLGP033NK
Micro Refrigerated Centrifuge	Cence	H1650-W
Microscope Slides	CITOGLAS	01-30253-50
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Normal Saline	CISEN	H37022337
Optical Microscope	Nikon	ECLIPSE E100
Parafilm	Bemis	PM-996
Phosphate-Buffered Saline	Beyotime	C0221A
Pipette Tip (1 mL )	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Scalpel	MARTOR	23111
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell	VORTEX KB3
Tweezer	Hystic	HKQS-180
Wright Staining Solution	Beyotime	C0135-500ml