Комплексный подход к анализу клеточных компонентов церебральных тромбов

Резюме

В этом исследовании описывается быстрый и эффективный метод анализа клеточных компонентов церебральных тромбов путем растворения сгустка, окрашивания клеток и рутинного исследования крови.

Аннотация

Церебральный тромбоз, тромб в мозговой артерии или вене, является наиболее распространенным типом инфаркта головного мозга. Исследование клеточных компонентов церебральных тромбов важно для диагностики, лечения и прогноза. Однако современные подходы к изучению клеточных компонентов сгустков в основном основаны на окрашивании in situ , которое не подходит для комплексного изучения клеточных компонентов, так как клетки плотно завернуты в сгустки. Предыдущие исследования успешно выделили фибринолитический фермент (sFE) из Sipunculus nudus, который может разрушать сшитый фибрин напрямую, высвобождая клеточные компоненты. В данном исследовании был создан комплексный метод изучения клеточных компонентов церебрального тромба на основе sFE. Этот протокол включает в себя растворение сгустка, высвобождение клеток, окрашивание клеток и рутинный анализ крови. Согласно этому методу, компоненты клетки могут быть изучены количественно и качественно. Приведены репрезентативные результаты экспериментов с использованием данного метода.

Введение

Цереброваскулярная болезнь является одним из трех основных заболеваний, которые могут угрожать здоровью человека, среди которых более 80% приходится на ишемическую цереброваскулярную болезнь. Церебральный тромбоз и тромбоз церебральных вен являются наиболее распространенными ишемическими цереброваскулярными заболеваниями на сегодняшний день, в основном вызываемыми церебральными тромбами ^1,2. Если лечение не проводится должным образом, оно будет иметь высокие показатели инвалидности и смертности, а также высокую частоту рецидивов^{после выписки}.

В последнее время все большее число исследований показало, что клеточные компоненты церебральных тромбов тесно коррелируют с диагностикой, лечением и прогнозом церебрального тромбоза ^4,5,6. Поэтому наличие данных о составе тромба, особенно клеточных компонентов, имеет важное значение для клинической диагностики и лечения. К сожалению, имеющиеся в настоящее время методы не могут всесторонне проанализировать компонент тромба количественно и качественно. Например, окрашивание на основе Martius Scarlett Blue in situ позволяет исследовать только красные/белые кровяные тельца определенных срезов сгустка⁷. Окрашивание in situ на основе иммуногистохимии (ИГХ) позволяет изучать только ограниченные компоненты крови определенных срезов тромба с использованием их антител⁸. Методы, основанные на микроскопических изображениях, касаются только специфической структуры сгустка⁹. Более того, все эти способы трудоемки и отнимают много времени¹⁰. На сегодняшний день о процедурах количественного и качественного исследования церебральных тромбальных клеточных компонентов не сообщается. Широко признано, что сшитый фибрин плотно обволакивает клетки крови в сгустки¹¹. Следовательно, специфическая деградация сшитого фибрина и высвобождение интактных клеток имеет решающее значение для точного анализа клеточных компонентов.

Предыдущие работы выделили фибринолитический фермент из Sipunculus nudus (sFE), который может специфически и быстро расщеплять фибрин¹². В работе предложен метод анализа клеточных компонентов церебральных тромбов, основанный на уникальной активности sFE. В этом протоколе сначала использовали sFE для разрушения фибрина сгустков, а затем анализировали клеточные компоненты с помощью окрашивания по методу Райта и рутинного анализа крови^13,14. Согласно этому методу, клеточные компоненты церебральных тромбов могут быть количественно и качественно изучены. Этот простой и эффективный протокол может быть применен для анализа клеточных компонентов других тромбов.

протокол

Исследование выполнено в соответствии с руководящими принципами Комитета по медицинской этике Университета Хуацяо. Тромбы головного мозга были удалены хирургическим путем и собраны в Первой больнице Цюаньчжоу, филиале Фуцзяньского медицинского университета, с информированного согласия пациентов.

1. Предварительная обработка сгустков крови

1. Поместите сгустки на чистую посуду, добавьте пинцетом 5 мл физиологического раствора, аккуратно встряхните посуду и удалите физиологический раствор пипеткой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите полоскание три раза.
2. Разрежьте сгустки на более мелкие кусочки (размером менее 5 мм x 5 мм x 5 мм) ножницами. Добавьте 5 мл физиологического раствора, аккуратно встряхните посуду и удалите физиологический раствор пипеткой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите полоскание три раза. Следите за тем, чтобы во время полоскания не отсасывались сгустки.
3. Перенесите сгустки на другую чистую U-образную пластину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь (хранить пластину при температуре 2-8 °C) и возобновить позже.

2. Тромболизис

1. Готовят рабочий раствор sFE, доводя концентрацию sFE до 2000 Ед/мл физиологическим раствором.
   ПРИМЕЧАНИЕ: sFE был подготовлен в соответствии с хорошо зарекомендовавшими себя протоколами Tang Lab¹⁵.
2. Добавьте 300 мкл рабочего раствора sFE в предварительно обработанные сгустки.
3. Выполните первый раунд деградации.
   1. Инкубируют смесь sFE и сгустков при 37 °C в течение 0,5 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Блоттинг, обработанный физиологическим раствором, был установлен в качестве отрицательного контроля. Не вращайте образец на шейкере.
   2. Аккуратно перемешайте пробу. Переложите жидкую часть в другую чистую пробирку с чистой пипеткой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшиеся сгустки были использованы для еще одного раунда разложения.
   3. Центрифугируют жидкую часть при 200 × г в течение 5 мин при 4 °С.
   4. Переложите надосадочную жидкость в другую чистую пробирку с помощью пипетки, чтобы получить восстановленный раствор sFE.
   5. Осторожно смешайте клеточный осадок с 50 мкл физиологического раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная смесь хранилась при температуре 2-8 °C для последующего использования.
4. Выполните последующую деградацию.
   1. Разлагают оставшиеся сгустки (этап 2.3.2) восстановленным раствором sFE (этап 2.3.4) при 37 °C в течение 0,5 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные этапы были такими же, как и в первом раунде деградации. Процесс разложения завершался до тех пор, пока не разлагались все сгустки.
5. Выполните сбор клеток.
   1. Подготовьте образец клеток крови, собрав клеточную смесь каждого раунда деградации.

3. Окрашивание Райта

1. Выполняют мазок из клеток.
   1. Доведите клетки до плотности 1 x 10⁶ клеток/мл.
   2. Добавьте 5 мкл клеток на предметное стекло с поли-L лизиновым покрытием, затем намажьте их с помощью покровного стекла.
   3. Выпарите жидкость комнатной температуры.
2. Выполните окрашивание.
   1. Аккуратно добавьте 200 мкл красителя Райта (см. таблицу материалов) в клеточный мазок и добавьте 600 мкл красителя Райта B для равномерного смешивания.  Окрашивать в течение 10 минут при комнатной температуре.
   2. Аккуратно смойте краситель чистой водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашенный клеточный мазок можно хранить при комнатной температуре для последующего использования.
3. Выполните микроскопическую визуализацию.
   1. Осмотрите окрашенные клетки с помощью светового микроскопа (см. Таблицу материалов).

4. Плановое исследование крови

1. Доведите клетки до плотности 1 x 10⁶ клеток/мл.
2. Анализ клеточных компонентов, таких как тромбоциты, эритроциты, лейкоциты, лимфоциты, нейтрофилы, моноциты, эозинофилы, базофилы и незрелые гранулоциты, с помощью аутогематологического анализатора в соответствии с инструкцией производителя (см. Таблицу материалов).

Результаты

На начальном этапе процесса деградации было установлено, что тромбы имели красную компактную структуру, а рабочий раствор был бесцветным. После инкубации в течение 30 мин рабочий раствор становился светло-красным, что указывало на то, что скрещенные клетки крови были высвобождены в раб?...

Обсуждение

sFE является фибринолитическим агентом, который может непосредственно и эффективно разрушать фибрин^12,16. Здесь sFE использовали для разрушения сшитого фибрина церебральных тромбов, высвобождения заключенных клеток внутри сгустков и качественного и колич?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agglutination Reaction Plate	ROTEST	RTB-4003
Auto Hematology Analyzer	SYSMEX	XNB2
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer	SANYO	MLS-3750
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Clean bench	AIRTECH	BLB-1600
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Culture Dish (100 mm)	NEST	704001
DHG Series Heating and Drying Oven	SENXIN	DGG-9140AD
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP	SLGP033NK
Micro Refrigerated Centrifuge	Cence	H1650-W
Microscope Slides	CITOGLAS	01-30253-50
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Normal Saline	CISEN	H37022337
Optical Microscope	Nikon	ECLIPSE E100
Parafilm	Bemis	PM-996
Phosphate-Buffered Saline	Beyotime	C0221A
Pipette Tip (1 mL )	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Scalpel	MARTOR	23111
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell	VORTEX KB3
Tweezer	Hystic	HKQS-180
Wright Staining Solution	Beyotime	C0135-500ml