Ein umfassender Ansatz zur Analyse der Zellbestandteile von zerebralen Blutgerinnseln

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt eine schnelle und effektive Methode zur Zellkomponentenanalyse von zerebralen Blutgerinnseln durch Gerinnselauflösung, Zellfärbung und routinemäßige Blutuntersuchung.

Zusammenfassung

Die Hirnthrombose, ein Blutgerinnsel in einer Hirnarterie oder -vene, ist die häufigste Art von Hirninfarkt. Die Untersuchung der Zellbestandteile von Blutgerinnseln im Gehirn ist wichtig für die Diagnose, Behandlung und Prognose. Die derzeitigen Ansätze zur Untersuchung der Zellbestandteile der Gerinnsel basieren jedoch hauptsächlich auf der In-situ-Färbung , die für die umfassende Untersuchung der Zellbestandteile ungeeignet ist, da die Zellen fest in die Gerinnsel eingewickelt sind. In früheren Studien ist es gelungen, ein fibrinolytisches Enzym (sFE) aus Sipunculus nudus zu isolieren, das das vernetzte Fibrin direkt abbauen und die Zellbestandteile freisetzen kann. In dieser Studie wurde eine umfassende Methode auf Basis der sFE etabliert, um die Zellkomponenten des zerebralen Thrombus zu untersuchen. Dieses Protokoll umfasst die Auflösung von Gerinnseln, die Zellfreigabe, die Zellfärbung und die routinemäßige Blutuntersuchung. Nach dieser Methode konnten die Zellbestandteile quantitativ und qualitativ untersucht werden. Die repräsentativen Ergebnisse von Experimenten mit dieser Methode werden gezeigt.

Einleitung

Zerebrovaskuläre Erkrankungen sind eine von drei Hauptkrankheiten, die die menschliche Gesundheit bedrohen können, von denen die ischämische zerebrovaskuläre Erkrankung mehr als 80 % ausmacht. Hirnthrombosen und Hirnvenenthrombosen sind heute die am stärksten betroffenen ischämischen zerebrovaskulären Erkrankungen, die hauptsächlich durch zerebrale Blutgerinnsel verursacht werden ^1,2. Wenn die Behandlung nicht richtig durchgeführt wird, führt sie zu einer hohen Behinderungs- und Mortalitätsrate und einer hohen Rezidivrate nach der Entlassung³.

In jüngster Zeit hat eine wachsende Zahl von Studien gezeigt, dass die Zellbestandteile von zerebralen Blutgerinnseln eng mit der Diagnose, Behandlung und Prognose der Hirnthrombose korrelieren ^4,5,6. Daher ist die Verfügbarkeit von Daten zur Thrombuszusammensetzung, insbesondere der Zellbestandteile, wichtig für die klinische Diagnose und Behandlung. Leider können die derzeit verfügbaren Methoden die Blutgerinnselkomponente nicht umfassend quantitativ und qualitativ analysieren. Zum Beispiel kann die auf Martius Scarlett Blue basierende In-situ-Färbung nur die roten/weißen Blutkörperchen bestimmter Schnitte des Gerinnsels⁷ untersuchen. Die auf Immunhistochemie (IHC) basierende In-situ-Färbung kann nur begrenzte Blutbestandteile bestimmter Schnitte des Gerinnsels anhand ihrer Antikörper untersuchen⁸. Die mikroskopischen bildbasierten Methoden befassen sich nur mit der spezifischen Struktur des Gerinnsels⁹. Darüber hinaus sind all diese Methoden mühsam und zeitaufwändig¹⁰. Bisher wurden die Verfahren zur quantitativen und qualitativen Untersuchung von zerebralen Thrombenzellbestandteilen nicht beschrieben. Es ist allgemein anerkannt, dass das vernetzte Fibrin die Blutzellen fest in die Gerinnsel einwickelt¹¹. Folglich ist der spezifische Abbau des vernetzten Fibrins und die Freisetzung der intakten Zellen entscheidend für die genaue Analyse von Zellbestandteilen.

In früheren Arbeiten wurde ein fibrinolytisches Enzym aus Sipunculus nudus (sFE) isoliert, das das Fibrin spezifisch und schnell abbauen kann¹². In dieser Arbeit wurde eine Methode zur Analyse der Zellkomponenten der zerebralen Thromben basierend auf der einzigartigen Aktivität von sFE vorgeschlagen. Dieses Protokoll nutzte sFE, um zuerst das Fibrin von Gerinnseln abzubauen, und analysierte dann die Zellbestandteile durch Wright-Färbung und routinemäßige Blutuntersuchung^13,14. Mit dieser Methode können die Zellbestandteile von Hirnthromben quantitativ und qualitativ untersucht werden. Dieses einfache und effektive Protokoll könnte für die Zellkomponentenanalyse anderer Blutgerinnsel angewendet werden.

Protokoll

Die Forschung wurde in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien der medizinischen Ethikkommission der Universität Huaqiao durchgeführt. Die zerebralen Blutgerinnsel wurden chirurgisch entfernt und im Quanzhou First Hospital, das der Fujian Medical University angegliedert ist, mit dem Einverständnis der Patienten entnommen.

1. Vorbehandlung von Blutgerinnseln

1. Geben Sie die Gerinnsel auf eine saubere Schale, fügen Sie 5 ml physiologische Kochsalzlösung mit einer Pinzette hinzu, schütteln Sie die Schale vorsichtig und entfernen Sie die Kochsalzlösung mit einer Pipette.
   HINWEIS: Wiederholen Sie die Spülung dreimal.
2. Die Gerinnsel mit einer Schere in kleinere Stücke (kleiner als 5 mm x 5 mm x 5 mm) schneiden. Fügen Sie 5 ml physiologische Kochsalzlösung hinzu, schütteln Sie die Schale vorsichtig und entfernen Sie die Kochsalzlösung mit einer Pipette.
   HINWEIS: Wiederholen Sie die Spülung dreimal. Stellen Sie sicher, dass während des Spülens keine Gerinnselstücke abgesaugt werden.
3. Übertragen Sie die Gerinnsel auf eine andere saubere U-Platte.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden (Platte bei 2-8 °C lagern) und später neu gestartet werden.

2. Thrombolyse

1. Bereiten Sie die sFE-Arbeitslösung vor, indem Sie die sFE-Konzentration mit physiologischer Kochsalzlösung auf 2000 U/ml einstellen.
   HINWEIS: Die sFE wurde nach den etablierten Protokollen von Tang Lab¹⁵ erstellt.
2. Geben Sie 300 μl sFE-Arbeitslösung in die vorbehandelten Gerinnsel.
3. Führen Sie die erste Abbaurunde durch.
   1. Das Gemisch aus sFE und Gerinnseln wird bei 37 °C für 0,5 h inkubiert.
      HINWEIS: Der mit physiologischer Kochsalzlösung behandelte Blot wurde als Negativkontrolle festgelegt. Drehen Sie die Probe nicht auf dem Schüttler.
   2. Mischen Sie die Probe vorsichtig. Füllen Sie den flüssigen Teil mit einer sauberen Pipette in ein anderes sauberes Röhrchen.
      HINWEIS: Die verbleibenden Gerinnsel wurden für eine weitere Abbaurunde verwendet.
   3. Der flüssige Teil wird bei 200 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
   4. Den Überstand mit einer Pipette in ein anderes sauberes Röhrchen überführen, um die zurückgewonnene sFE-Lösung zu erhalten.
   5. Mischen Sie die Zellpräzipitation vorsichtig mit 50 μl physiologischer Kochsalzlösung.
      HINWEIS: Die Zellmischung wurde für die spätere Verwendung bei 2-8 °C gelagert.
4. Führen Sie eine anschließende Verschlechterung durch.
   1. Die verbleibenden Gerinnsel (Schritt 2.3.2) werden mit der gewonnenen sFE-Lösung (Schritt 2.3.4) bei 37 °C für 0,5 h abgebaut.
      HINWEIS: Die Ruheschritte waren die gleichen wie bei der ersten Abbaurunde. Der Abbauprozess wurde beendet, bis die gesamten Gerinnsel abgebaut waren.
5. Führen Sie die Zellsammlung durch.
   1. Bereiten Sie die Blutkörperchenprobe vor, indem Sie die Zellmischung jeder Abbaurunde sammeln.

3. Wright-Färbung

1. Führen Sie einen Zellabstrich durch.
   1. Stellen Sie die Zellen auf eine Dichte von 1 x 10⁶ Zellen/ml ein.
   2. Geben Sie 5 μl der Zellen in den mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger und schmieren Sie sie dann mit dem Deckglas ein.
   3. Verdampfen Sie die Flüssigkeit bei Raumtemperatur.
2. Führen Sie die Färbung durch.
   1. Geben Sie 200 μl Wright-Farbstoff (siehe Materialtabelle) vorsichtig in den Zellabstrich und fügen Sie 600 μl Wright-Farbstoff B hinzu, um ihn gleichmäßig zu mischen.  10 min bei Raumtemperatur einfärben.
   2. Spülen Sie die Farbe vorsichtig mit klarem Wasser ab.
      HINWEIS: Der gefärbte Zellausstrich kann zur späteren Verwendung bei Raumtemperatur gelagert werden.
3. Führen Sie mikroskopische Bildgebung durch.
   1. Untersuchen Sie die gefärbten Zellen mit einem Lichtmikroskop (siehe Materialtabelle).

4. Routinemäßige Blutuntersuchung

1. Stellen Sie die Zellen auf eine Dichte von 1 x 10⁶ Zellen/ml ein.
2. Analysieren Sie die Zellbestandteile wie Blutplättchen, Erythrozyten, weiße Blutkörperchen, Lymphozyten, Neutrophile, Monozyten, Eosinophile, Basophile und unreife Granulozyten mit einem Autohämatologie-Analysegerät gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).

Ergebnisse

In der Anfangsphase des Abbauprozesses wurde festgestellt, dass die Blutgerinnsel eine rote, kompakte Struktur aufwiesen und die Arbeitslösung farblos war. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten färbte sich die Arbeitslösung hellrot, was darauf hindeutete, dass die gekreuzten Blutzellen in die Arbeitslösung freigesetzt wurden. Die meisten Gerinnsel lösten sich auf, wenn die Inkubationszeit auf 5 h verlängert wurde, und die Arbeitslösung wurde hellrot. Im Gegenteil, es gab auch nach 10 h Inkubation keine signifi...

Diskussion

sFE ist ein fibrinolytisches Mittel, das das Fibrin direkt und effektiv abbauen kann^12,16. Hier wurde sFE eingesetzt, um das vernetzte Fibrin der zerebralen Blutgerinnsel abzubauen, die eingeschlossenen Zellen innerhalb der Gerinnsel freizusetzen und die Zellbestandteile der Gerinnsel qualitativ und quantitativ zu analysieren. Die mikroskopischen Daten und die routinemäßige Blutuntersuchung zeigten, dass die eingeschlossenen Zellen aus den Blutgerinnseln freige...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agglutination Reaction Plate	ROTEST	RTB-4003
Auto Hematology Analyzer	SYSMEX	XNB2
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer	SANYO	MLS-3750
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Clean bench	AIRTECH	BLB-1600
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Culture Dish (100 mm)	NEST	704001
DHG Series Heating and Drying Oven	SENXIN	DGG-9140AD
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP	SLGP033NK
Micro Refrigerated Centrifuge	Cence	H1650-W
Microscope Slides	CITOGLAS	01-30253-50
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Normal Saline	CISEN	H37022337
Optical Microscope	Nikon	ECLIPSE E100
Parafilm	Bemis	PM-996
Phosphate-Buffered Saline	Beyotime	C0221A
Pipette Tip (1 mL )	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Scalpel	MARTOR	23111
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell	VORTEX KB3
Tweezer	Hystic	HKQS-180
Wright Staining Solution	Beyotime	C0135-500ml