Un enfoque integral para analizar los componentes celulares de los coágulos sanguíneos cerebrales

Resumen

Este estudio describe un método rápido y eficaz para el análisis de componentes celulares de coágulos sanguíneos cerebrales a través de la disolución de coágulos, la tinción celular y el examen de sangre de rutina.

Resumen

La trombosis cerebral, un coágulo de sangre en una arteria o vena cerebral, es el tipo más común de infarto cerebral. El estudio de los componentes celulares de los coágulos sanguíneos cerebrales es importante para el diagnóstico, el tratamiento y el pronóstico. Sin embargo, los enfoques actuales para estudiar los componentes celulares de los coágulos se basan principalmente en la tinción in situ , que no es adecuada para el estudio exhaustivo de los componentes celulares porque las células están firmemente envueltas en los coágulos. Estudios anteriores han aislado con éxito una enzima fibrinolítica (sFE) de Sipunculus nudus, que puede degradar la fibrina reticulada directamente, liberando los componentes celulares. Este estudio estableció un método integral basado en el sFE para estudiar los componentes celulares del trombo cerebral. Este protocolo incluye la disolución de coágulos, la liberación de células, la tinción de células y el examen de sangre de rutina. De acuerdo con este método, los componentes celulares podrían estudiarse cuantitativa y cualitativamente. Se muestran los resultados representativos de los experimentos realizados con este método.

Introducción

La enfermedad cerebrovascular es una de las tres principales enfermedades que pueden amenazar la salud humana, entre las cuales la enfermedad cerebrovascular isquémica representa más del 80%. La trombosis cerebral y la trombosis venosa cerebral son las enfermedades cerebrovasculares isquémicas más preocupantes en la actualidad, causadas principalmente por coágulos sanguíneos cerebrales ^1,2. Si el tratamiento no se realiza adecuadamente, tendrá altas tasas de discapacidad y mortalidad y una alta tasa de recurrencia después del alta³.

Recientemente, un número creciente de estudios ha demostrado que los componentes celulares de los coágulos sanguíneos cerebrales están estrechamente correlacionados con el diagnóstico, tratamiento y pronóstico de la trombosis cerebral ^4,5,6. Por lo tanto, la disponibilidad de datos sobre la composición de los trombos, especialmente los componentes celulares, es importante para el diagnóstico clínico y el tratamiento. Desafortunadamente, los métodos disponibles actualmente no pueden analizar exhaustivamente el componente del coágulo de sangre cuantitativa y cualitativamente. Por ejemplo, la tinción in situ basada en Martius Scarlett Blue solo puede estudiar los glóbulos rojos/blancos de ciertas rebanadas del coágulo⁷. La tinción in situ basada en la inmunohistoquímica (IHQ) solo puede estudiar componentes sanguíneos limitados de ciertos cortes del coágulo utilizando sus anticuerpos⁸. Los métodos basados en imágenes microscópicas solo se ocupan de la estructura específica del coágulo⁹. Además, todos estos métodos son laboriosos y requieren mucho tiempo¹⁰. Hasta la fecha, no se han descrito los procedimientos para estudiar cuantitativa y cualitativamente los componentes de las células trombos cerebrales. Es ampliamente reconocido que la fibrina reticulada envuelve firmemente las células sanguíneas en los coágulos¹¹. En consecuencia, la degradación específica de la fibrina reticulada y la liberación de las células intactas es fundamental para el análisis preciso de los componentes celulares.

Trabajos previos aislaron una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (sFE), que puede degradar la fibrina de manera específica y rápida¹². En este trabajo, se propuso un método para analizar los componentes celulares de los trombos cerebrales basado en la actividad única de sFE. Este protocolo utilizó sFE para degradar primero la fibrina de los coágulos y luego analizó los componentes celulares mediante tinción de Wright y análisis de sangre de rutina^13,14. De acuerdo con este método, los componentes celulares de los trombos cerebrales pueden ser estudiados cuantitativa y cualitativamente. Este protocolo simple y efectivo podría aplicarse para el análisis de componentes celulares de otros coágulos sanguíneos.

Protocolo

La investigación se realizó de acuerdo con las directrices institucionales del Comité de Ética Médica de la Universidad de Huaqiao. Los coágulos sanguíneos cerebrales se extirparon quirúrgicamente y se recogieron en el Primer Hospital de Quanzhou, afiliado a la Universidad Médica de Fujian, con el consentimiento informado de los pacientes.

1. Pretratamiento de coágulos de sangre

1. Coloque los coágulos en un plato limpio, agregue 5 ml de solución salina fisiológica con una pinza, agite el plato suavemente y retire la solución salina con una pipeta.
   NOTA: Repita el enjuague tres veces.
2. Corta los coágulos en trozos más pequeños (menos de 5 mm x 5 mm x 5 mm) con una tijera. Añadir 5 ml de solución salina fisiológica, agitar el plato suavemente y retirar la solución salina con una pipeta.
   NOTA: Repita el enjuague tres veces. Asegúrese de que no se aspiren trozos de coágulos durante el enjuague.
3. Transfiera los coágulos a otra placa en U limpia.
   NOTA: El protocolo puede pausarse aquí (almacenar la placa a 2-8 °C) y reiniciarse más tarde.

2. Trombólisis

1. Prepare la solución de trabajo de sFE ajustando la concentración de sFE a 2000 U/mL con solución salina fisiológica.
   NOTA: El sFE se preparó de acuerdo con los protocolos bien establecidos de Tang Lab¹⁵.
2. Añadir 300 μL de solución de trabajo de sFE en los coágulos pretratados.
3. Realice la primera ronda de degradación.
   1. Incubar la mezcla de sFE y coágulos a 37 °C durante 0,5 h.
      NOTA: El blot tratado con suero fisiológico se estableció como control negativo. No gire la muestra sobre el agitador.
   2. Mezcle la muestra suavemente. Transfiera la parte líquida a otro tubo limpio con una pipeta limpia.
      NOTA: Los coágulos restantes se utilizaron para otra ronda de degradación.
   3. Centrifugar la parte líquida a 200 × g durante 5 min a 4 °C.
   4. Transfiera el sobrenadante a otro tubo limpio con una pipeta para obtener la solución de sFE recuperada.
   5. Mezclar suavemente la precipitación celular con 50 μL de solución salina fisiológica.
      NOTA: La mezcla de células se almacenó a 2-8 °C para su uso posterior.
4. Realice la degradación posterior.
   1. Degradar los coágulos restantes (paso 2.3.2) con la solución de sFE recuperada (paso 2.3.4) a 37 °C durante 0,5 h.
      NOTA: Los pasos de descanso fueron los mismos que en la primera ronda de degradación. El proceso de degradación se terminaba hasta que se degradaban todos los coágulos.
5. Realice la recolección de células.
   1. Prepare la muestra de células sanguíneas recogiendo la mezcla celular de cada ronda de degradación.

3. Tinción de Wright

1. Realizar frotis celular.
   1. Ajuste las celdas a una densidad de 1 x 10⁶ células/ml.
   2. Agregue 5 μL de las células al portaobjetos de vidrio recubierto de poli-L lisina, luego úntelas con el cubreobjetos.
   3. Evapora el líquido a temperatura ambiente.
2. Realice la tinción.
   1. Agregue 200 μL de colorante de Wright (consulte la Tabla de materiales) al frotis celular suavemente y agregue 600 μL de colorante B de Wright para mezclar uniformemente.  Tiñir durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   2. Enjuaga el tinte suavemente con agua limpia.
      NOTA: El frotis de células teñidas se puede almacenar a temperatura ambiente para su uso posterior.
3. Realizar imágenes microscópicas.
   1. Examine las células teñidas con un microscopio óptico (consulte la Tabla de materiales).

4. Examen de sangre de rutina

1. Ajuste las celdas a una densidad de 1 x 10⁶ células/ml.
2. Analice los componentes celulares como plaquetas, eritrocitos, glóbulos blancos, linfocitos, neutrófilos, monocitos, eosinófilos, basófilos y granulocitos inmaduros utilizando un analizador de autohematología de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales).

Resultados

En la etapa inicial del proceso de degradación, se encontró que los coágulos de sangre tenían una estructura compacta roja y la solución de trabajo era incolora. Después de la incubación durante 30 minutos, la solución de trabajo se volvió de color rojo claro, lo que indicaba que las células sanguíneas cruzadas se liberaron en la solución de trabajo. La mayoría de los coágulos se disolvieron al alargar el tiempo de incubación a 5 h, y la solución de trabajo se volvió de color rojo claro. Por el contrario...

Discusión

El sFE es un agente fibrinolítico que puede degradar la fibrina de forma directa y eficaz^12,16. Aquí, el sFE se empleó para degradar la fibrina reticulada de los coágulos sanguíneos cerebrales, liberar las células encerradas dentro de los coágulos y analizar los componentes celulares de los coágulos cualitativa y cuantitativamente. Los datos de la microscopía y el examen de sangre de rutina indicaron que las células encerradas se liberaron de los coágu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agglutination Reaction Plate	ROTEST	RTB-4003
Auto Hematology Analyzer	SYSMEX	XNB2
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer	SANYO	MLS-3750
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Clean bench	AIRTECH	BLB-1600
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Culture Dish (100 mm)	NEST	704001
DHG Series Heating and Drying Oven	SENXIN	DGG-9140AD
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP	SLGP033NK
Micro Refrigerated Centrifuge	Cence	H1650-W
Microscope Slides	CITOGLAS	01-30253-50
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Normal Saline	CISEN	H37022337
Optical Microscope	Nikon	ECLIPSE E100
Parafilm	Bemis	PM-996
Phosphate-Buffered Saline	Beyotime	C0221A
Pipette Tip (1 mL )	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Scalpel	MARTOR	23111
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell	VORTEX KB3
Tweezer	Hystic	HKQS-180
Wright Staining Solution	Beyotime	C0135-500ml