Un approccio completo per analizzare i componenti cellulari dei coaguli di sangue cerebrale

Riepilogo

Questo studio descrive un metodo rapido ed efficace per l'analisi dei componenti cellulari dei coaguli di sangue cerebrale attraverso la dissoluzione del coagulo, la colorazione cellulare e l'esame del sangue di routine.

Abstract

La trombosi cerebrale, un coagulo di sangue in un'arteria o vena cerebrale, è il tipo più comune di infarto cerebrale. Lo studio dei componenti cellulari dei coaguli di sangue cerebrale è importante per la diagnosi, il trattamento e la prognosi. Tuttavia, gli attuali approcci allo studio dei componenti cellulari dei coaguli si basano principalmente sulla colorazione in situ , che non è adatta per lo studio completo dei componenti cellulari perché le cellule sono strettamente avvolte nei coaguli. Studi precedenti hanno isolato con successo un enzima fibrinolitico (sFE) da Sipunculus nudus, che può degradare direttamente la fibrina reticolata, rilasciando i componenti cellulari. Questo studio ha stabilito un metodo completo basato sull'sFE per studiare i componenti cellulari del trombo cerebrale. Questo protocollo include la dissoluzione del coagulo, il rilascio cellulare, la colorazione cellulare e l'esame del sangue di routine. Secondo questo metodo, i componenti cellulari potrebbero essere studiati quantitativamente e qualitativamente. Vengono mostrati i risultati rappresentativi degli esperimenti che utilizzano questo metodo.

Introduzione

La malattia cerebrovascolare è una delle tre principali malattie che possono minacciare la salute umana, tra le quali la malattia cerebrovascolare ischemica rappresenta oltre l'80%. La trombosi cerebrale e la trombosi venosa cerebrale sono oggi le malattie cerebrovascolari ischemiche più preoccupanti, causate principalmente da coaguli di sangue cerebrale ^1,2. Se il trattamento non viene eseguito correttamente, avrà alti tassi di disabilità e mortalità e un alto tasso di recidiva dopo la dimissione³.

Recentemente, un numero crescente di studi ha dimostrato che i componenti cellulari dei coaguli di sangue cerebrale sono strettamente correlati con la diagnosi, il trattamento e la prognosi della trombosi cerebrale ^4,5,6. Pertanto, la disponibilità di dati sulla composizione del trombo, in particolare sui componenti cellulari, è importante per la diagnosi clinica e il trattamento. Sfortunatamente, i metodi attualmente disponibili non sono in grado di analizzare in modo completo la componente del coagulo di sangue quantitativamente e qualitativamente. Ad esempio, la colorazione in situ a base di Martius Scarlett Blue può studiare solo i globuli rossi/bianchi di alcune fette del coagulo⁷. La colorazione in situ basata sull'immunoistochimica (IHC) può studiare solo i componenti limitati del sangue di alcune fette del coagulo utilizzando i loro anticorpi⁸. I metodi basati su immagini microscopiche riguardano solo la struttura specifica del coagulo⁹. Inoltre, tutti questi metodi sono laboriosi e richiedono molto tempo¹⁰. Ad oggi, le procedure per lo studio quantitativo e qualitativo dei componenti delle cellule trombiformi cerebrali non sono state riportate. È ampiamente riconosciuto che la fibrina reticolata avvolge strettamente le cellule del sangue nei coaguli¹¹. Di conseguenza, la degradazione specifica della fibrina reticolata e il rilascio delle cellule intatte sono fondamentali per l'analisi accurata dei componenti cellulari.

Lavori precedenti hanno isolato un enzima fibrinolitico da Sipunculus nudus (sFE), che può degradare la fibrina in modo specifico e rapido¹². In questo caso, è stato proposto un metodo per analizzare i componenti cellulari dei trombi cerebrali basato sull'attività unica di sFE. Questo protocollo ha utilizzato sFE per degradare prima la fibrina dei coaguli e poi ha analizzato i componenti cellulari mediante colorazione di Wright ed esame del sangue^{di routine 13,14}. Secondo questo metodo, i componenti cellulari dei trombi cerebrali possono essere studiati quantitativamente e qualitativamente. Questo protocollo semplice ed efficace potrebbe essere applicato per l'analisi della componente cellulare di altri coaguli di sangue.

Protocollo

La ricerca è stata condotta in conformità con le linee guida istituzionali del Comitato di Etica Medica dell'Università di Huaqiao. I coaguli di sangue cerebrale sono stati rimossi chirurgicamente e raccolti presso il Quanzhou First Hospital, affiliato alla Fujian Medical University, con il consenso informato dei pazienti.

1. Pretrattamento del coagulo di sangue

1. Disporre i coaguli su un piatto pulito, aggiungere 5 ml di soluzione fisiologica con una pinzetta, agitare delicatamente il piatto e rimuovere la soluzione fisiologica con una pipetta.
   NOTA: Ripetere il risciacquo tre volte.
2. Tagliare i coaguli in pezzi più piccoli (più piccoli di 5 mm x 5 mm x 5 mm) con una forbice. Aggiungere 5 mL di soluzione fisiologica, agitare delicatamente la capsula e rimuovere la soluzione fisiologica con una pipetta.
   NOTA: Ripetere il risciacquo tre volte. Assicurarsi che non vengano aspirati pezzi di coagulo durante il risciacquo.
3. Trasferire i coaguli su un'altra piastra a U pulita.
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui (conservare la piastra a 2-8 °C) e riavviato in un secondo momento.

2. Trombolisi

1. Preparare la soluzione di lavoro sFE regolando la concentrazione di sFE a 2000 U/mL con soluzione fisiologica.
   NOTA: L'sFE è stato preparato secondo i protocolli consolidati di Tang Lab¹⁵.
2. Aggiungere 300 μL di soluzione di lavoro sFE nei coaguli pretrattati.
3. Eseguire il primo ciclo di degradazione.
   1. Incubare la miscela di sFE e coaguli a 37 °C per 0,5 ore.
      NOTA: Il blot trattato con soluzione fisiologica è stato impostato come controllo negativo. Non ruotare il campione sull'agitatore.
   2. Mescolare delicatamente il campione. Trasferire la parte liquida in un'altra provetta pulita con una pipetta pulita.
      NOTA: I coaguli rimanenti sono stati utilizzati per un altro ciclo di degradazione.
   3. Centrifugare la parte liquida a 200 × g per 5 min a 4 °C.
   4. Trasferire il surnatante in un'altra provetta pulita con una pipetta per ottenere la soluzione di sFE recuperata.
   5. Miscelare delicatamente la precipitazione cellulare con 50 μL di soluzione fisiologica.
      NOTA: La miscela cellulare è stata conservata a 2-8 °C per un uso successivo.
4. Eseguire la successiva degradazione.
   1. Degradare i coaguli rimanenti (fase 2.3.2) con la soluzione di sFE recuperata (fase 2.3.4) a 37 °C per 0,5 ore.
      NOTA: Le fasi di riposo sono state le stesse del primo ciclo di degradazione. Il processo di degradazione è stato completato fino a quando l'intero coagulo non è stato degradato.
5. Eseguire la raccolta delle celle.
   1. Preparare il campione di cellule del sangue raccogliendo la miscela cellulare di ogni ciclo di degradazione.

3. La colorazione di Wright

1. Eseguire lo striscio cellulare.
   1. Regolare le celle su una densità di 1 x 10⁶ cellule/mL.
   2. Aggiungere 5 μL di cellule al vetrino rivestito di poli-L con lisina, quindi spalmarle con il vetrino coprioggetto.
   3. Evaporare il liquido a temperatura ambiente.
2. Eseguire la colorazione.
   1. Aggiungere delicatamente 200 μL di colorante di Wright (vedere la tabella dei materiali) allo striscio cellulare e aggiungere 600 μL di colorante B di Wright per mescolare uniformemente.  Colorare per 10 minuti a temperatura ambiente.
   2. Risciacquare delicatamente la tintura con acqua pulita.
      NOTA: Lo striscio di cellule colorate può essere conservato a temperatura ambiente per un uso successivo.
3. Eseguire l'imaging microscopico.
   1. Esaminare le cellule colorate con un microscopio ottico (vedere la tabella dei materiali).

4. Esame del sangue di routine

1. Regolare le celle su una densità di 1 x 10⁶ cellule/mL.
2. Analizzare i componenti cellulari come piastrine, eritrociti, globuli bianchi, linfociti, neutrofili, monociti, eosinofili, basofili e granulociti immaturi utilizzando un analizzatore autoematologico secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).

Risultati

Nella fase iniziale del processo di degradazione, è stato riscontrato che i coaguli di sangue avevano una struttura compatta rossa e la soluzione di lavoro era incolore. Dopo un'incubazione di 30 minuti, la soluzione di lavoro è diventata di colore rosso chiaro, il che indica che le cellule del sangue incrociate sono state rilasciate nella soluzione di lavoro. La maggior parte dei coaguli si è dissolta quando si è allungato il tempo di incubazione a 5 ore e la soluzione di lavoro è diventata rosso chiaro. Al contrar...

Discussione

sFE è un agente fibrinolitico in grado di degradare la fibrina direttamente ed efficacemente^12,16. Qui, sFE è stato impiegato per degradare la fibrina reticolata dei coaguli di sangue cerebrale, rilasciare le cellule racchiuse all'interno dei coaguli e analizzare qualitativamente e quantitativamente i componenti cellulari dei coaguli. I dati della microscopia e l'esame del sangue di routine hanno indicato che le cellule racchiuse sono state rilasciate dai coagu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agglutination Reaction Plate	ROTEST	RTB-4003
Auto Hematology Analyzer	SYSMEX	XNB2
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer	SANYO	MLS-3750
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Clean bench	AIRTECH	BLB-1600
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Culture Dish (100 mm)	NEST	704001
DHG Series Heating and Drying Oven	SENXIN	DGG-9140AD
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP	SLGP033NK
Micro Refrigerated Centrifuge	Cence	H1650-W
Microscope Slides	CITOGLAS	01-30253-50
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Normal Saline	CISEN	H37022337
Optical Microscope	Nikon	ECLIPSE E100
Parafilm	Bemis	PM-996
Phosphate-Buffered Saline	Beyotime	C0221A
Pipette Tip (1 mL )	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Scalpel	MARTOR	23111
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell	VORTEX KB3
Tweezer	Hystic	HKQS-180
Wright Staining Solution	Beyotime	C0135-500ml