JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه المقالة بروتوكولا لاستخراج الحمض النووي للدياتوم باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الشائعة المعدلة.

Abstract

اختبار الدياتوم هو وسيلة مساعدة أساسية في ممارسة الطب الشرعي لتحديد ما إذا كانت الجثة قد غرقت في الماء واستنتاج موقع الغرق. اختبار الدياتوم هو أيضا محتوى بحثي مهم في مجال البيئة والعوالق. تعد تقنية اختبار البيولوجيا الجزيئية للدياتوم ، والتي تركز على الحمض النووي للدياتوم ككائن بحثي أساسي ، طريقة جديدة لاختبار الدياتوم. استخراج الحمض النووي للدياتوم هو أساس الاختبار الجزيئي للدياتوم. في الوقت الحاضر ، تعتبر المجموعات المستخدمة بشكل شائع لاستخراج الحمض النووي للدياتوم باهظة الثمن ، مما يزيد من تكلفة إجراء البحوث ذات الصلة. قام مختبرنا بتحسين مجموعة الاستخراج السريع للحمض النووي لجينوم الدم الكامل العام وحصل على تأثير استخراج الحمض النووي للدياتوم بشكل مرض ، وبالتالي توفير حل بديل اقتصادي وبأسعار معقولة لاستخراج الحمض النووي يعتمد على الخرز الزجاجي للأبحاث ذات الصلة. يمكن أن يلبي الحمض النووي للدياتوم المستخرج باستخدام هذا البروتوكول العديد من التطبيقات النهائية ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل والتسلسل.

Introduction

في ممارسة الطب الشرعي ، يعد تحديد ما إذا كانت الجثة التي تم العثور عليها في الماء تغرق أو ألقيت في الماء بعد الوفاة أمرا ضروريا للحل المناسب للقضية1. كما أنها واحدة من القضايا الصعبة التي تحتاج إلى حل عاجل في ممارسة الطبالشرعي 2. الدياتومات وفيرة في البيئة الطبيعية (خاصة في الماء)3,4. في عملية الغرق ، بسبب نقص الأكسجة والاستجابة للإجهاد ، سيكون لدى الناس حركات تنفس مكثفة ويستنشقون كمية كبيرة من سائل الغرق. لذلك ، تدخل الدياتومات الموجودة في الماء إلى الرئة بسائل الغرق ، ويمكن لبعض الدياتومات أن تدخل الدورة الدموية من خلال الحاجز السنخي الشعري وتنتشر إلى الأعضاء الداخلية مع تدفق الدم 5,6. يعد اكتشاف الدياتومات في الأنسجة والأعضاء الداخلية مثل الرئة والكبد ونخاع العظام دليلا قويا على الغرق قبل الموت 7,8. حاليا ، يعتمد اختبار الدياتوم الشرعي بشكل أساسي على طرق الاختبار المورفولوجية. بعد سلسلة من الهضم المسبق للأنسجة ، يتم إجراء التقديرات النوعية والكمية المورفولوجية للدياتومات غير المهضومة تحت المجهر. خلال هذه الفترة ، يجب استخدام الكواشف الخطرة وغير الصديقة للبيئة مثل حمض النيتريك. تستغرق هذه العملية وقتا طويلا وتتطلب من الباحثين أن يكون لديهم خبرة تصنيفية قوية وتجربة واسعة. كل هذا يجلب بعض التحديات لموظفي الطب الشرعي9. تقنية اختبار الحمض النووي للدياتوم هي تقنية جديدة لاختبار المشطورات تم تطويرها في السنوات الأخيرة10،11،12. تحقق هذه التقنية تحديد الأنواع من الدياتومات من خلال تحليل تكوين تسلسل الحمض النووي المحدد للدياتومات13,14. تقنية PCR وتكنولوجيا التسلسل هي طرق تقنية شائعة الاستخدام ، ولكن أساسها هو الاستخراج الناجح للحمض النووي من الدياتومات. ومع ذلك ، فإن الدياتومات لها بنية خاصة مختلفة عن الكائنات الحية الأخرى ، مما يجعل تقنيات استخراج الحمض النووي مختلفة أيضا.

يحتوي جدار الخلية في المشطورة على درجة عالية من السيليكات ، ومكونه الرئيسي هو ثاني أكسيد السيليكون15،16،17. جدار الخلية السيليسية صعب للغاية ، ويجب تدميره قبل استخراج الحمض النووي. غالبا ما يصعب استخدام مجموعات استخراج الحمض النووي العادية مباشرة لاستخراج الحمض النووي للدياتوم لأنها لا تستطيع تدمير القشرة السيليسية للدياتومات18. لذلك ، فإن تدمير القشرة السيليسية للدياتومات هو أحد المشكلات التقنية الرئيسية التي يجب حلها في استخراج الحمض النووي للدياتوم.

في الوقت نفسه ، نظرا لأن عدد الدياتومات الموجودة في عينات أبحاث الطب الشرعي ، سواء كانت عينات مياه أو أعضاء وأنسجة الجثث الغارقة ، غالبا ما يكون محدودا ، فمن الضروري إثراء الدياتومات. جوهر التخصيب هو فصل المواد. أثناء محاولة جمع الدياتومات معا ، قلل من محتوى مكونات المواد الأخرى (المكونات المتداخلة). في أعمال الطب الشرعي ، غالبا ما تستخدم المختبرات طرق الطرد المركزي أو الإثراء بالترشيح الغشائي لفصل خلايا المشطورة19. ومع ذلك ، نظرا لعدم استخدام معدات ضخ الفراغ على نطاق واسع ، فإن طريقة التخصيب الغشائي لا تستخدم غالبا في مختبرات الطب الشرعي الأولية العادية. لذلك ، لا تزال طريقة الطرد المركزي شائعة تخصيب الدياتوم في مختبرات الطب الشرعي20.

يستخدم استخراج الحمض النووي من الدياتومات حاليا في المقام الأول في ممارسة الطب الشرعي ، وهناك قيود كبيرة على تطبيقه. في الوقت الحاضر ، هناك عدد قليل من مجموعات استخراج الحمض النووي للدياتوم المستخدمة في علوم الطب الشرعي في السوق وهي باهظة الثمن بشكل عام21. توفر هذه المقالة طريقة محسنة لاستخراج الحمض النووي للدياتوم ، مما يجعل استخراج الحمض النووي للدياتوم بسيطا ومريحا وفعالا من حيث التكلفة. هذا يزيد من تطبيق اختبار البيولوجيا الجزيئية اللاحقة للدياتومات ويمكن أن يحل بشكل أفضل المشاكل المتعلقة بالغرق في الطب الشرعي من خلال اختبار الدياتوم. هذه الطريقة تكسر جدران الخلايا السيليسية للدياتومات عن طريق إضافة حبات زجاجية وتحديد وقت مناسب للدوامة. بهذه الطريقة ، يقوم البروتيناز K ومحلول الربط بتحليل الخلايا بسرعة وتعطيل الإنزيمات المختلفة في الخلايا. يتم امتصاص الحمض النووي الجينومي في غشاء المصفوفة في عمود الامتزاز وأخيرا يتم استخلاصه بواسطة محلول الشطف. تعمل مجموعة استخراج جينات الدم الكاملة المحسنة هذه على تحسين تأثير استخراج الحمض النووي للدياتوم لمجموعة الدم في مواد فحص الطب الشرعي ، وتقلل من تكلفة استخراج الحمض النووي للدياتوم في ممارسة الطب الشرعي ، ويمكن تطبيقها بشكل أفضل على أبحاث الطب الشرعي الشعبية.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة هاينان الطبية. لا تعتبر عينات الأنسجة المستخدمة في هذه الدراسة دراسات تشمل أشخاصا. تم الحصول على هذه العينات لغرض التشخيص المرضي الشرعي ، وتم استخدام الباقي لاستخراج الحمض النووي للدياتوم في هذه التجربة. لا يمكن للباحثين تحديد الأفراد بسهولة للحصول على موافقة مستنيرة من أصحاب المصلحة المعنيين.

ملاحظة: لضمان التطبيق العام لطريقة البحث المبلغ عنها في هذه التجربة ، اتبعت هذه التجربة بشكل أساسي تعليمات التشغيل الخاصة بالمجموعة المستخدمة ، وتم تعديل بعض الخطوات فقط. أخذت عينات المياه المستخدمة في هذه التجربة عشوائيا من البرك القريبة من المختبر (الشكل التكميلي 1 أ). في هذه التجربة ، تم تأكيد أنسجة الرئة في الجسم الغارق كنسيج بحثي لإثبات بروتوكول الاستخراج (الشكل التكميلي 1B). في ممارسة الطب الشرعي ، من الضروري أيضا في بعض الأحيان استخدام أعضاء وأنسجة أخرى من الأجسام الغارقة (مثل الكبد والطحال والكلى ونخاع العظام ، وما إلى ذلك) لاستخراج الحمض النووي للدياتومات ، الأمر الذي يتطلب تحسينات طفيفة مقابلة لهذه الطريقة التجريبية ، والتي سيتم شرحها في القسم المقابل من التجربة. جاءت عينات أنسجة الرئة المستخدمة في هذه التجربة من جثث غرقت بوضوح في قضايا الطب الشرعي. تم إجراء اختبارات مورفولوجية لإثبات أن أنسجة الرئة تحتوي على الدياتومات (الشكل التكميلي 2).

1. المعالجة المسبقة للعينات

  1. المعالجة المسبقة لعينات المياه
    1. خذ 10 مل من عينة الماء في أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي عند 13400 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص بعناية من 9.8 مل من المادة الطافية بمسدس ماصة ، وانقل حوالي 200 ميكرولتر من عينة ماء المشطورة المخصبة المتبقية في القاع إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل.
      ملاحظة: يمكن إجراء التجربة المسبقة أولا ، ويمكن زيادة الكمية الأولية إذا كانت عينة ماء 10 مل غير كافية للتخصيب.
  2. المعالجة المسبقة لعينات الأنسجة
    1. خذ 0.5 غرام من أنسجة هامش الرئة من الجسم الغارق ، أو قم بقطع أنسجة الرئة أو طحنها بالكامل حتى تصبح موحلة. منع تلوث الدياتومات الخارجية هو جوهر هذه الخطوة. قطع الأنسجة إلى قطع بشكل متكرر باستخدام مقص.

2. استخراج الحمض النووي

ملاحظة: يتم الانتهاء من جميع خطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة. استخدام جهاز طرد مركزي مكتبي بقوة طرد مركزي تبلغ 14500 × جم ؛ يجب تحضير حمام مائي (أو حمام معدني) مسخن مسبقا إلى 70 درجة مئوية قبل بدء التجربة. يجب أن تتبع جميع الخطوات بدقة مبادئ التشغيل التعقيم.

  1. تجميع عينات المياه والأنسجة
    ملاحظة: عينة الماء وطريقة استخراج الحمض النووي للدياتوم هي نفسها.
    1. أضف حبات زجاجية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل يحتوي على عينة المياه المعالجة مسبقا. اقلب 10x-15x لتخلط جيدا. تتكون الخرزات الزجاجية المضافة من خرز زجاجي كبير وصغير ممزوج بنسبة كتلة 1: 1. قطر الخرز الزجاجي الكبير 1.5-2.0 مم والخرز الزجاجي الصغير 0.4-0.6 مم.
    2. خذ 0.5 غرام من الأنسجة المفرومة ناعما ، أضف حبات زجاجية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل يحتوي على الأنسجة كما هو موضح أعلاه. اقلب 10x-15x للخلط.
  2. أضف 40 ميكرولتر من بروتيناز K (20 مجم / مل) إلى الأنابيب. ضعه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، خلال هذه الفترة ، اقلبه واخلطه 10 مرات كل 3 دقائق.
    ملاحظة: إذا لم يتم هضم الأنسجة بالكامل ، يمكن زيادة كمية البروتين K بشكل مناسب حتى يصبح المحلول واضحا.
  3. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط إلى أنابيب الطرد المركزي ، دوامة على الفور ، واخلطها لمدة 4 دقائق (تردد خلط التذبذب: 3000 دورة في الدقيقة).
    ملاحظة: في هذه الخطوة ، يجب التحكم بدقة في شدة الاهتزاز والوقت لضمان كثافة ووقت خلط كافيين.
  4. ضع أنابيب الطرد المركزي في حمام مائي 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ويصبح الحل واضحا.
  5. أضف 100 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى أنابيب الطرد المركزي ، دوامة واخلطها لمدة 15 ثانية ، قد يظهر هطول الأمطار الندف في هذا الوقت.
    ملاحظة: من المهم جدا الاختلاط جيدا مع القوة المناسبة في خطوات العملية المذكورة أعلاه ، ولكن يجب تجنب الاهتزاز القوي لمنع قص الحمض النووي.
  6. ضع المحلول الذي تم الحصول عليه في الخطوة السابقة مع راسب الندف في عمود الامتزاز (يتم وضع عمود الامتزاز في أنبوب التجميع). طول عمود الامتزاز 3.0 سم ، وقطره 1.0 سم ، ومصفوفة الامتزاز عبارة عن غشاء مصفوفة السيليكون.
  7. جهاز طرد مركزي عند 8000 × جم لمدة 30 ثانية ، تخلص من سائل النفايات في أنبوب التجميع وأعد عمود الامتزاز إلى أنبوب التجميع.
  8. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة المانع إلى عمود الامتزاز. أجهزة طرد مركزي عند 13400 × جم لمدة 30 ثانية وتخلص من سائل النفايات في أنبوب التجميع.
  9. أضف 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى عمود الامتزاز. أجهزة طرد مركزي عند 13400 × جم لمدة 30 ثانية وتخلص من سائل النفايات في أنبوب التجميع.
    ملاحظة: أضف الكمية المحددة من الإيثانول المطلق إلى زجاجة الغسيل العازلة قبل الاستخدام لأول مرة.
  10. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى عمود الامتزاز. أجهزة طرد مركزي عند 13400 × جم لمدة 30 ثانية وتخلص من سائل النفايات في أنبوب التجميع.
  11. ضع عمود الامتزاز مرة أخرى في أنبوب التجميع الفارغ. أجهزة الطرد المركزي عند 14500 × جم لمدة 2 دقيقة ، وإزالة المخزن المؤقت للغسيل قدر الإمكان ، لتجنب الإيثانول المتبقي في مخزن الغسيل المؤقت من تثبيط تفاعلات المصب.
  12. أخرج عمود الامتزاز وضعه في أنبوب طرد مركزي نظيف. أضف 100 ميكرولتر من محلول الشطف إلى الجزء الأوسط من غشاء الامتزاز.
  13. ضع عمود الامتزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقائق ، وأجهزة الطرد المركزي عند 13400 × جم لمدة 1 دقيقة.
  14. أضف الحل الذي تم الحصول عليه في الخطوة السابقة إلى عمود امتزاز الطرد المركزي مرة أخرى. ضع عمود الامتزاز بالطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 13400 × جم لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: يجب تسخين محلول الشطف مسبقا في حمام مائي بدرجة حرارة 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا. يجب ألا يقل حجم الشطف عن 50 ميكرولتر ؛ خلاف ذلك ، سيتم تقليل عائد الحمض النووي.
  15. قم بتخزين الحمض النووي للدياتوم المستخرج في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. إذا كان سيتم تخزين محلول الحمض النووي لفترة طويلة ، فقم بتخزينه عند -20 درجة مئوية.

3. اختبار PCR

ملاحظة: نظرا لأن محتوى الدياتومات في عينات الطب الشرعي غالبا ما يكون منخفضا ، فقد تحتوي مستخلصات عينات الأنسجة للجثث الغارقة أيضا على درجات متفاوتة من الأنسجة والأعضاء (مثل الرئتين في هذه التجربة) مع الحمض النووي الخاص بها. لذلك ، فإن الكشف المباشر عن إجمالي الحمض النووي في مستخلصات الحمض النووي لا يعكس حالة استخراج الحمض النووي للدياتوم. في هذه التجربة ، تم اختيار البادئات الخاصة بالدياتوم ، وتم استخدام منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتقييم استخراج الحمض النووي للدياتوم في المستخلص. يمكن ملاحظة المنتجات وتحليلها عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز ويمكن أيضا تحليلها بواسطة منحنى ذوبان PCR الكمي الفلوري في الوقت الفعلي ، والذي يتميز بحساسية أعلى.

  1. أضف 2 ميكرولتر من الحمض النووي المستخرج من عينات المياه والأنسجة كقالب. اختر إحدى الطريقتين التاليتين للفحص.
  2. اختبار PCR التقليدي
    1. استخدم البادئات22 التي يمكنها تضخيم شظايا المشتراتوم 18S rDNA على وجه التحديد. لمزيد من التفاصيل، انظر الجدول 1.
    2. إنشاء نظام تفاعل PCR وظروف التضخيم وفقا لخصائص الاشعال. لمزيد من التفاصيل، انظر الجدول 2.
    3. قم بتشغيل منتجات تضخيم PCR على هلام الأغاروز 2٪. مراقبة وتحليل التصوير باستخدام جهاز تصوير هلام.
  3. اختبار PCR الكمي الفلوري
    1. استخدم البادئات المذكورة أعلاه التي يمكنها على وجه التحديد تضخيم شظايا المشطورة 18S rDNA لإعداد نظام تفاعل PCR الكمي الفلوري في الوقت الفعلي. لمزيد من التفاصيل، انظر الجدول 3.
    2. قم بإجراء تضخيم PCR وتحليل منحنى التضخيم الذي تم الحصول عليه وقيم Ct. في الوقت نفسه ، قم بتعيين برنامج ، وقم بإذابة الخيوط المزدوجة للمنتجات المضخمة إلى خيوط مفردة تدريجيا من خلال تقنية منحنى ذوبان PCR الكمي الفلوري ، ثم قم بتحليل منحنيات الذوبان التي تم الحصول عليها.

النتائج

نظرا لأن محلول الحمض النووي المستخرج بواسطة طريقة استخراج الحمض النووي المستخدمة حاليا يحتوي على جميع مكونات الحمض النووي من مصادر مختلفة في العينة ، فإن الحمض النووي الذي تم الحصول عليه بواسطة هذا البروتوكول لم يكن استثناء. لذلك ، لم يكن محلول الحمض النووي مجرد محلول للحمض النووي الجيني...

Discussion

خلايا المشطورة محمية بجدران الخلايا السيليسية الصلبة17 ، ويجب تدمير هذا الهيكل لاستخراج الحمض النووي للدياتوم. المجموعات العادية لا تدمر بسهولة القشرة السيليسية للدياتومات ؛ وبالتالي من الصعب استخراج الحمض النووي للدياتوم21 بنجاح. قام مختبرنا بتحسين مجموعة است?...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

يتم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82060341،81560304) ومشروع البحث العلمي لمنصة الابتكار الأكاديمي في مقاطعة هاينان (YSPTZX202134).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Binding BufferBioTekeB010006022rapidly lysing cells
ChemoHS qPCR MixMonad00007547-120506qPCR Mix
D2000 DNA ladderReal-Times(Beijing) BiotechnologyRTM415Measure the position of electrophoretic bands
D512Taihe BiotechnologyTW21109196forword primer
D978Taihe BiotechnologyTW21109197reverse primer
Elution bufferBioTekeB010006022A low-salt elution buffer washes off the DNA
Glass beadYingxu Chemical Machinery(Shanghai) 70181000Special glass beads for dispersing and grinding
Import adsorption columnBioTekeB2008006022Adsorption column with silica matrix membrane
Inhibitor Removal BufferBioTekeB010006022Removal of Inhibitors in DNA Extraction
IsopropanolBioTekeB010006022Precipitate or isolate DNA
MIX-30S Mini MixerMiulabMUC881206oscillatory action
Proteinase KBioTekeB010006022Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Rotor-Gene Q 5plex HRMQiagenR1116175real-time fluorescence quantification PCR
Speed Micro-CentrifugeScilogex9013001121centrifuge
Tanon 3500R Gel ImagerTanon16T5553R-455gel imaging
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR Mix
Thermo CyclerZhuhai HemaVRB020Aordinary PCR
Wash BufferBioTekeB010006022Remove impurities such as cell metabolites

References

  1. Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
  2. Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
  3. Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
  4. Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
  5. Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
  6. Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
  7. Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
  8. Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
  9. Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
  10. Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
  11. Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
  12. Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
  13. Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
  14. Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
  15. Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
  16. Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
  17. Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
  18. Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
  19. Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
  20. Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
  21. Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
  22. Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
  23. Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
  24. Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
  25. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
  26. Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
  27. Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
  28. Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
  29. Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
  30. Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
  31. Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
  32. Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
  33. Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

201 PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved