물 샘플 및 조직에서 규조류 DNA 추출

요약

이 글에서는 수정된 일반 DNA 추출 키트를 사용한 규조류 DNA 추출 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

규조류 검사는 법의학 실무에서 시체가 물에 빠졌는지 여부를 결정하고 익사 위치를 추론하는 데 필수적인 보조 수단입니다. 규조류 검사는 환경과 플랑크톤 분야에서도 중요한 연구 내용입니다. 규조류 DNA를 주요 연구 대상으로 하는 규조류 분자 생물학 검사 기술은 규조류 검사의 새로운 방법입니다. 규조류 DNA 추출은 규조류 분자 검사의 기초입니다. 현재 규조류 DNA 추출에 일반적으로 사용되는 키트는 고가이므로 관련 연구 수행 비용이 증가합니다. 우리 연구실은 일반 전혈 유전체 DNA 신속 추출 키트를 개선하여 만족스러운 규조류 DNA 추출 효과를 얻어 관련 연구를 위한 글라스 비드 기반의 경제적이고 저렴한 대안 DNA 추출 솔루션을 제공합니다. 이 프로토콜을 사용하여 추출된 규조류 DNA는 PCR 및 염기서열분석과 같은 많은 다운스트림 응용 분야를 만족시킬 수 있습니다.

서문

법의학에서는 물속에서 발견된 시체가 익사했는지 아니면 사망 후 물에 던져졌는지를 판단하는 것이 사건의 적절한 해결을 위해 필수적이다¹. 또한 법의학 실무에서 시급히 해결해야 할 어려운 문제 중 하나입니다². 규조류는 자연 환경(특히 물)에 풍부합니다.^3,4. 익사 과정에서 저산소증과 스트레스 반응으로 인해 사람들은 격렬한 호흡 움직임을 보이고 많은 양의 익사 액체를 흡입합니다. 따라서 물 속의 규조류는 익사액과 함께 폐로 들어가고 일부 규조류는 폐포-모세혈관 장벽을 통해 혈액 순환에 들어가 혈류와 함께 내부 장기로 퍼질 수 있습니다 ^5,6. 폐, 간, 골수와 같은 내부 조직과 장기에서 규조류가 검출되는 것은 사망 전 익사의 강력한 증거입니다 ^7,8. 현재 법의학 규조류 검사는 주로 형태학적 검사 방법을 기반으로 합니다. 조직의 일련의 사전 소화 후, 소화되지 않은 규조류의 형태학적 정성적 및 정량적 추정이 현미경 하에서 수행됩니다. 이 기간 동안 질산과 같은 위험하고 환경 친화적이지 않은 시약을 사용해야 합니다. 이 프로세스는 시간이 많이 걸리며 연구자는 확실한 분류학 전문 지식과 광범위한 경험을 필요로 합니다. 이 모든 것은 법의학 직원에게 특정 문제를 야기합니다⁹. 규조류 DNA 검사 기술은 최근 몇 년 동안 개발된 규조류 검사의 새로운 기술입니다 10,11,12. 이 기술은 규조류^13,14의 특정 DNA 서열 조성을 분석하여 규조류의 종 식별을 실현합니다. PCR 기술과 시퀀싱 기술은 일반적으로 사용되는 기술적 방법이지만 그 기본은 규조류에서 DNA를 성공적으로 추출하는 것입니다. 그러나 규조류는 다른 유기체와 다른 특별한 구조를 가지고 있어 DNA 추출 기술도 다릅니다.

규조류의 세포벽은 규화도가 높으며 주성분은 이산화규소^15,16,17입니다. 규산질 세포벽은 매우 단단하며 DNA를 추출하기 전에 파괴해야 합니다. 통상의 DNA 추출 키트는 규조류¹⁸의 규산질 껍질을 파괴할 수 없기 때문에 규조류 DNA의 추출에 직접 사용하기 어려운 경우가 많다. 따라서 규조류의 규산 껍질을 파괴하는 것은 규조류 DNA를 추출할 때 해결해야 할 주요 기술 문제 중 하나입니다.

동시에 법의학 연구 샘플에 포함된 규조류의 수는 물 샘플이든 익사한 시체의 장기 및 조직이든 종종 제한되어 있기 때문에 규조류를 농축할 필요가 있습니다. 농축의 본질은 물질의 분리입니다. 규조류를 함께 모으려고 할 때 다른 재료 구성 요소(간섭 구성 요소)의 함량을 최소화합니다. 법의학 작업에서, 실험실은 규조류 세포를 분리하기 위해 종종 원심분리 또는 막 여과 농축 방법을 사용한다¹⁹. 그러나 진공 펌핑 장비가 널리 사용되지 않기 때문에 멤브레인 농축 방법은 일반 1차 법의학 실험실에서 자주 사용되지 않습니다. 따라서, 원심분리 방법은 여전히 법의학 실험실(²⁰)에서 규조류 농축이다.

규조류에서 DNA를 추출하는 것은 현재 법의학 분야에서 주로 사용되며 그 적용에는 상당한 한계가 있습니다. 현재 시중에 법의학에 사용되는 규조류 DNA 추출 키트는 거의 없으며 일반적으로 고가입니다²¹. 이 기사는 규조류 DNA 추출을 간단하고 편리하며 비용 효율적으로 만드는 개선된 규조류 DNA 추출 방법을 제공합니다. 이는 규조류의 후속 분자 생물학 테스트의 적용을 증가시키고 규조류 테스트를 통해 법의학에서 익사와 관련된 문제를 더 잘 해결할 수 있습니다. 이 방법은 유리 구슬을 첨가하고 소용돌이에 적절한 시간을 설정하여 규조류의 규산 세포벽을 파괴합니다. 이러한 방식으로 단백질 분해 효소 K와 결합 용액은 세포를 빠르게 용해시키고 세포 내의 다양한 효소를 비활성화합니다. 게놈 DNA는 흡착 컬럼의 매트릭스 막에 흡수되고 최종적으로 용출 완충액에 의해 용출됩니다. 이러한 개선된 전혈 유전자 추출 키트는 법의학 검사 재료에서 혈액 키트의 규조류 DNA 추출 효과를 향상시키고, 법의학 실무에서 규조류 DNA 추출 비용을 절감하며, 풀뿌리 법의학 연구에 더 잘 적용될 수 있습니다.

프로토콜

이 연구는 하이난 의과 대학 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구에 사용된 조직 샘플은 인간 피험자와 관련된 연구로 간주되지 않습니다. 이 표본은 법의학 병리학적 진단을 위해 얻었고 나머지는 이 실험에서 규조류 DNA 추출에 사용되었습니다. 연구자는 관련 이해 관계자로부터 정보에 입각한 동의를 얻기 위해 개인을 쉽게 식별할 수 없습니다.

참고: 이 실험에서 보고된 연구 방법의 일반적인 적용 가능성을 보장하기 위해 이 실험은 기본적으로 사용된 키트의 작동 지침을 따랐으며 일부 단계만 수정되었습니다. 이 실험에 사용된 물 샘플은 실험실 근처의 연못에서 무작위로 채취되었습니다(보충 그림 1A). 이 실험에서는 익사한 시신의 폐 조직을 추출 프로토콜을 입증하기 위한 연구 조직으로 확인하였다(보충 그림 1B). 법의학 실습에서는 규조류 DNA를 추출하기 위해 익사한 시체의 다른 장기 및 조직(예: 간, 비장, 신장, 골수 등)을 사용해야 하는 경우도 있으며, 이는 실험의 해당 섹션에서 설명할 이 실험 방법에 대한 약간의 개선이 필요합니다. 이 실험에 사용된 폐 조직 샘플은 법의학 사례에서 익사한 것이 분명한 시체에서 나왔다. 폐 조직에 규조류가 포함되어 있음을 증명하기 위해 형태학적 검사가 수행되었습니다(보충 그림 2).

1. 샘플의 전처리

1. 물 샘플의 전처리
   1. 10mL의 물 샘플을 원심분리기 튜브에 넣고 13,400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 피펫 건으로 9.8mL의 상층액을 조심스럽게 버리고 바닥에 남아 있는 약 200μL의 농축 규조수 샘플을 2mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
      참고: 사전 실험을 먼저 수행할 수 있으며 10mL의 물 샘플이 농축에 충분하지 않은 경우 초기 양을 늘릴 수 있습니다.
2. 조직 샘플의 전처리
   1. 익사한 몸에서 폐 가장자리 조직 0.5g을 채취하여 폐 조직이 진흙탕이 될 때까지 완전히 자르거나 갈아줍니다. 외인성 규조류의 오염을 방지하는 것이 이 단계의 핵심입니다. 가위를 사용하여 티슈를 반복적으로 조각으로 자릅니다.

2. DNA 추출

알림: 모든 원심분리 단계는 실온에서 완료됩니다. 원심력이 14,500 x g인 데스크탑 원심분리기를 사용하는 단계; 실험을 시작하기 전에 70°C로 예열된 수조(또는 금속 수조)를 준비해야 합니다. 모든 단계는 무균 작동 원칙을 엄격히 따라야 합니다.

1. 물 샘플 및 조직 조립
   참고: 물 샘플과 조직 규조류 DNA 추출 방법은 동일합니다.
   1. 전처리된 물 샘플이 들어 있는 2mL 원심분리기 튜브에 유리 구슬을 추가합니다. 10x-15x를 뒤집어 잘 섞습니다. 첨가된 유리구슬은 크고 작은 유리구슬이 1:1의 질량비로 혼합되어 구성된다. 큰 유리 구슬의 직경은 1.5-2.0mm이고 작은 유리 구슬의 직경은 0.4-0.6mm입니다.
   2. 잘게 썬 조직 0.5g을 위에서 설명한 대로 조직이 들어 있는 2mL 원심분리 튜브에 유리 구슬을 추가합니다. 10x-15x를 뒤집어 혼합합니다.
2. 40μL의 proteinase K(20mg/mL)를 튜브에 추가합니다. 실온에서 15분 동안 두었다가 이 기간 동안 뒤집어서 3분마다 10번 섞습니다.
   참고: 조직이 완전히 소화되지 않으면 용액이 맑아질 때까지 proteinase K의 양을 적절하게 늘릴 수 있습니다.
3. 원심분리기 튜브에 결합 완충액 200μL를 추가하고 즉시 와류를 발생시키고 4분 동안 혼합합니다(진동 혼합 주파수: 3000rpm).
   알림: 이 단계에서는 충분한 혼합 강도와 시간을 보장하기 위해 흔들림 강도와 시간을 엄격하게 제어해야 합니다.
4. 원심분리기 튜브를 70°C 수조에 10분 동안 넣으면 용액이 투명해집니다.
5. 100μL의 이소프로판올을 원심분리기 튜브에 넣고 소용돌이 및 15초 동안 혼합하면 이때 응집성 침전이 나타날 수 있습니다.
   알림: 위의 작업 단계에서 적절한 강도로 잘 혼합하는 것이 매우 중요하지만 DNA 전단을 방지하기 위해 격렬한 흔들림은 피해야 합니다.
6. 이전 단계에서 얻은 용액을 응집성 침전물과 함께 흡착 컬럼에 넣습니다(흡착 컬럼은 수집 튜브에 배치됨). 흡착 컬럼 길이는 3.0cm, 직경은 1.0cm, 흡착 매트릭스는 실리콘 매트릭스 멤브레인입니다.
7. 8,000 x g 에서 30초 동안 원심분리기를 사용하여 수집 튜브의 폐액을 버리고 흡착 컬럼을 수집 튜브에 다시 넣습니다.
8. 500μL의 억제제 제거 완충액을 흡착 컬럼에 추가합니다. 13,400 x g 에서 30초 동안 원심분리하고 수집 튜브에 있는 폐액을 버립니다.
9. 700μL의 세척 버퍼를 흡착 컬럼에 추가합니다. 13,400 x g 에서 30초 동안 원심분리하고 수집 튜브에 있는 폐액을 버립니다.
   알림: 처음 사용하기 전에 세척 버퍼 병에 지정된 양의 절대 에탄올을 추가하십시오.
10. 500μL의 세척 완충액을 흡착 컬럼에 추가합니다. 13,400 x g 에서 30초 동안 원심분리하고 수집 튜브에 있는 폐액을 버립니다.
11. 흡착 컬럼을 빈 수집 튜브에 다시 넣습니다. 14,500 x g 에서 2분 동안 원심분리하고 세척 완충액을 최대한 제거하여 세척 완충액의 잔류 에탄올이 다운스트림 반응을 억제하지 않도록 합니다.
12. 흡착 컬럼을 꺼내 깨끗한 원심분리기 튜브에 넣습니다. 100μL의 용출 완충액을 흡착막의 중간 부분에 추가합니다.
13. 흡착 컬럼을 실온에 3-5분 동안 놓고 13,400 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
14. 이전 단계에서 얻은 용액을 원심 흡착 컬럼에 다시 추가합니다. 원심 흡착 컬럼을 실온에서 2분 동안 놓고 13,400 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
    알림: 용출 버퍼는 70°C 수조에서 약 10분 동안 예열해야 합니다. 용출량은 50μL 이상이어야 합니다. 그렇지 않으면 DNA 수율이 감소합니다.
15. 추출된 규조류 DNA를 나중에 사용할 수 있도록 2-8°C에서 보관합니다. DNA 용액을 장기간 보관해야 하는 경우 -20°C에서 보관하십시오.

3. PCR 검사

참고: 법의학 샘플의 규조류 함량이 낮은 경우가 많기 때문에 익사한 시신의 조직 샘플 추출물에는 자체 DNA가 있는 다양한 정도의 조직과 장기(예: 이 실험의 폐)가 포함될 수도 있습니다. 따라서 DNA 추출물에서 전체 DNA를 직접 검출하는 것은 규조류 DNA 추출의 상황을 반영하지 않습니다. 이 실험에서는 규조류 특이적 프라이머를 선택하고 PCR 산물을 사용하여 추출물에서 규조류 DNA 추출을 평가했습니다. 제품은 아가로스 겔 전기영동으로 관찰 및 분석할 수 있으며 감도가 더 높은 실시간 형광 정량 PCR 용융 곡선으로도 분석할 수 있습니다.

1. 물 샘플과 조직에서 추출한 DNA 2μL를 템플릿으로 추가합니다. 다음 두 가지 검사 방법 중 하나를 선택합니다.
2. 기존 PCR 검사
   1. 규조류 18S rDNA 단편을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머²² 를 사용합니다. 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오.
   2. 프라이머의 특성에 따라 PCR 반응 시스템 및 증폭 조건을 설정합니다. 자세한 내용은 표 2를 참조하십시오.
   3. PCR 증폭 산물을 2% 아가로스 겔에서 실행합니다. 겔 이미저로 이미징을 관찰하고 분석합니다.
3. 형광 정량 PCR 검사
   1. 규조류 18S rDNA 단편을 특이적으로 증폭할 수 있는 위의 프라이머를 사용하여 실시간 형광 정량 PCR 반응 시스템을 준비합니다. 자세한 내용은 표 3을 참조하십시오.
   2. PCR 증폭을 수행하고, 얻어진 증폭 곡선 및 Ct 값을 분석한다. 동시에 프로그램을 설정하고 형광 정량 PCR 용융 곡선 기술을 통해 증폭된 제품의 이중 가닥을 점차적으로 단일 가닥으로 녹인 다음 얻은 용융 곡선을 분석합니다.

결과

현재 사용되는 DNA 추출 방법에 의해 추출된 DNA 용액은 샘플의 다른 출처에서 추출된 모든 DNA 성분을 포함하기 때문에 이 프로토콜에 의해 얻어진 DNA도 예외는 아니었습니다. 따라서 DNA 용액은 규조류 게놈 DNA의 단순한 용액이 아니었습니다. 규조류 18S rDNA 단편을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머는 문헌 22,23,24를 참조하여 선택하였다.

토론

규조류 세포는 단단한 규산질 세포벽(¹⁷)에 의해 보호되며, 규조류 DNA를 추출하기 위해서는 이 구조를 파괴해야 한다. 일반 키트는 규조류의 규산 껍질을 쉽게 파괴하지 않습니다. 따라서 규조류 DNA²¹을 성공적으로 추출하는 것은 어렵다. 우리 연구실은 규조류 추출 과정에서 직경과 질량비가 다른 유리 구슬을 추가하여 가장 일반적으로 사용되는 혈액 DNA 추출 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binding Buffer	BioTeke	B010006022	rapidly lysing cells
ChemoHS qPCR Mix	Monad	00007547-120506	qPCR Mix
D2000 DNA ladder	Real-Times(Beijing) Biotechnology	RTM415	Measure the position of electrophoretic bands
D512	Taihe Biotechnology	TW21109196	forword primer
D978	Taihe Biotechnology	TW21109197	reverse primer
Elution buffer	BioTeke	B010006022	A low-salt elution buffer washes off the DNA
Glass bead	Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)	70181000	Special glass beads for dispersing and grinding
Import adsorption column	BioTeke	B2008006022	Adsorption column with silica matrix membrane
Inhibitor Removal Buffer	BioTeke	B010006022	Removal of Inhibitors in DNA Extraction
Isopropanol	BioTeke	B010006022	Precipitate or isolate DNA
MIX-30S Mini Mixer	Miulab	MUC881206	oscillatory action
Proteinase K	BioTeke	B010006022	Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Rotor-Gene Q 5plex HRM	Qiagen	R1116175	real-time fluorescence quantification PCR
Speed Micro-Centrifuge	Scilogex	9013001121	centrifuge
Tanon 3500R Gel Imager	Tanon	16T5553R-455	gel imaging
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Thermo Cycler	Zhuhai Hema	VRB020A	ordinary PCR
Wash Buffer	BioTeke	B010006022	Remove impurities such as cell metabolites