물 샘플 및 조직에서 규조류 DNA 추출

요약

이 글에서는 수정된 일반 DNA 추출 키트를 사용한 규조류 DNA 추출 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

규조류 검사는 법의학 실무에서 시체가 물에 빠졌는지 여부를 결정하고 익사 위치를 추론하는 데 필수적인 보조 수단입니다. 규조류 검사는 환경과 플랑크톤 분야에서도 중요한 연구 내용입니다. 규조류 DNA를 주요 연구 대상으로 하는 규조류 분자 생물학 검사 기술은 규조류 검사의 새로운 방법입니다. 규조류 DNA 추출은 규조류 분자 검사의 기초입니다. 현재 규조류 DNA 추출에 일반적으로 사용되는 키트는 고가이므로 관련 연구 수행 비용이 증가합니다. 우리 연구실은 일반 전혈 유전체 DNA 신속 추출 키트를 개선하여 만족스러운 규조류 DNA 추출 효과를 얻어 관련 연구를 위한 글라스 비드 기반의 경제적이고 저렴한 대안 DNA 추출 솔루션을 제공합니다. 이 프로토콜을 사용하여 추출된 규조류 DNA는 PCR 및 염기서열분석과 같은 많은 다운스트림 응용 분야를 만족시킬 수 있습니다.

서문

법의학에서는 물속에서 발견된 시체가 익사했는지 아니면 사망 후 물에 던져졌는지를 판단하는 것이 사건의 적절한 해결을 위해 필수적이다¹. 또한 법의학 실무에서 시급히 해결해야 할 어려운 문제 중 하나입니다². 규조류는 자연 환경(특히 물)에 풍부합니다.^3,4. 익사 과정에서 저산소증과 스트레스 반응으로 인해 사람들은 격렬한 호흡 움직임을 보이고 많은 양의 익사 액체를 흡입합니다. 따라서 물 속의 규조류는 익사액과 함께 폐로 들어가고 일부 규조류는 폐포-모세혈관 장벽을 통해 혈액 순환에 들어가 혈류와 함께 내부 장기로 퍼질 수 있습니다 ^5,6. 폐, 간, 골수와 같은 내부 조직과 장기에서 규조류가 검출되는 것은 사망 전 익사의 강력한 증거입니다 ^7,8. 현재 법의학 규조류 검사는 주로 형태학적 검사 방법을 기반으로 합니다. 조직의 일련의 사전 소화 후, 소화되지 않은 규조류의 형태학적 정성적 및 정량....

프로토콜

이 연구는 하이난 의과 대학 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구에 사용된 조직 샘플은 인간 피험자와 관련된 연구로 간주되지 않습니다. 이 표본은 법의학 병리학적 진단을 위해 얻었고 나머지는 이 실험에서 규조류 DNA 추출에 사용되었습니다. 연구자는 관련 이해 관계자로부터 정보에 입각한 동의를 얻기 위해 개인을 쉽게 식별할 수 없습니다.

참고: 이 실험에서 보고된 연구 방법의 일반적인 적용 가능성을 보장하기 위해 이 실험은 기본적으로 사용된 키트의 작동 지침을 따랐으며 일부 단계만 수정되었습니다. 이 실험에 사용된 물 샘플은 실험실 근처의 연못에서 무작위로 채취되었습니다(보충 그림 1A). 이 실험에서는 익사한 시신의 폐 조직을 추출 프로토콜을 입증하기 위한 연구 조직으로 확인하였다(보충 그림 1B). 법의학 실습에서는 규조류 DNA를 추출하기 위해 익사한 시체의 다른 장기 및 조직(예: 간, 비장, 신장, 골수 등)을 사용해야 하는 경우도 있으며, 이는 실험의 해당 섹션에서 설명할 이 실험 방법에 대한 약간의 개선이 필요합니다. 이 실험에 사용된 폐 조직 샘플은 법의학 사례에서 익사한 것이 분명한 시체에서 나왔다. 폐 조직에 규조류가 포함되어 있음을 증명하기 위해 형태학적 검사....

토론

규조류 세포는 단단한 규산질 세포벽(¹⁷)에 의해 보호되며, 규조류 DNA를 추출하기 위해서는 이 구조를 파괴해야 한다. 일반 키트는 규조류의 규산 껍질을 쉽게 파괴하지 않습니다. 따라서 규조류 DNA²¹을 성공적으로 추출하는 것은 어렵다. 우리 연구실은 규조류 추출 과정에서 직경과 질량비가 다른 유리 구슬을 추가하여 가장 일반적으로 사용되는 혈액 DNA 추출 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binding Buffer	BioTeke	B010006022	rapidly lysing cells
ChemoHS qPCR Mix	Monad	00007547-120506	qPCR Mix
D2000 DNA ladder	Real-Times(Beijing) Biotechnology	RTM415	Measure the position of electrophoretic bands
D512	Taihe Biotechnology	TW21109196	forword primer
D978	Taihe Biotechnology	TW21109197	reverse primer
Elution buffer	BioTeke	B010006022	A low-salt elution buffer washes off the DNA
Glass bead	Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)	70181000	Special glass beads for dispersing and grinding
Import adsorption column	BioTeke	B2008006022	Adsorption column with silica matrix membrane
Inhibitor Removal Buffer	BioTeke	B010006022	Removal of Inhibitors in DNA Extraction
Isopropanol	BioTeke	B010006022	Precipitate or isolate DNA
MIX-30S Mini Mixer	Miulab	MUC881206	oscillatory action
Proteinase K	BioTeke	B010006022	Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Rotor-Gene Q 5plex HRM	Qiagen	R1116175	real-time fluorescence quantification PCR
Speed Micro-Centrifuge	Scilogex	9013001121	centrifuge
Tanon 3500R Gel Imager	Tanon	16T5553R-455	gel imaging
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Thermo Cycler	Zhuhai Hema	VRB020A	ordinary PCR
Wash Buffer	BioTeke	B010006022	Remove impurities such as cell metabolites