水試料および組織からの珪藻DNAの抽出

要約

この記事は修正された共通のDNAの抽出のキットを使用して珪藻DNAの抽出のためのプロトコルを記述する。

要約

珪藻の検査は、死体が水中で溺死したかどうかを判断し、溺死した場所を推測するために、法医学の実践において不可欠な補助手段です。珪藻試験は、環境・プランクトンの分野においても重要な研究内容です。珪藻DNAを主な研究対象とする珪藻分子生物学的試験技術は、珪藻の新しい試験方法です。珪藻DNA抽出は、珪藻分子試験の基本です。現在、珪藻DNA抽出に一般的に使用されているキットは高価であり、関連する研究を実施するためのコストが増加します。私たちの研究室は、一般的な全血ゲノムDNA迅速抽出キットを改良し、満足のいく珪藻DNA抽出効果を得て、関連研究のためのガラスビーズに基づく代替の経済的で手頃な価格のDNA抽出ソリューションを提供しました。このプロトコルを使用して抽出された珪藻DNAは、PCRやシーケンシングなど、多くの下流アプリケーションを満たすことができます。

概要

法医学の実践では、水中で発見された死体が溺死したのか、それとも死後に水中に投げ込まれたのかを判断することは、事件¹の適切な解決に不可欠です。また、法医学の実践²において緊急に解決しなければならない難しい問題の1つでもあります。珪藻は自然環境(特に水中)に豊富に存在します^3,4。溺死の過程で、低酸素症とストレス反応により、人々は激しい呼吸運動をし、溺れる液体を大量に吸い込みます。したがって、水中の珪藻は溺れた液体とともに肺に入り、一部の珪藻は肺胞毛細血管関門を介して血液循環に入り、^{血流とともに}内臓に広がる可能性があります^5,6。肺、肝臓、骨髄などの内部組織や臓器で珪藻が検出されることは、死ぬ前に溺死したことを示す強力な証拠です^7,8。現在、法医学的珪藻試験は、主に形態学的試験方法に基づいています。組織の一連の前消化の後、未消化珪藻の形態学的定性的および定量的推定が顕微鏡下で行われる。この期間中は、硝酸などの危険で環境に優しくない試薬を使用する必要があります。このプロセスには時間がかかり、研究者は分類学の確かな専門知識と豊富な経験を持っている必要があります。これらはすべて、法医学スタッフに特定の課題をもたらします⁹.珪藻DNA検査技術は、近年開発された珪藻検査の新技術である10,11,12。本技術は、珪藻の特異的なDNA配列構成を解析することにより、珪藻の種同定を実現する^13,14。PCR技術やシーケンシング技術は一般的に用いられる技術的手法ですが、その基本は珪藻からのDNA抽出の成功です。しかし、珪藻は他の生物とは異なる特殊な構造をしており、DNA抽出技術も異なります。

珪藻の細胞壁は珪化度が高く、その主成分は二酸化ケイ素15,16,17です。珪質細胞壁は非常に硬く、DNAを抽出する前に破壊する必要があります。通常のDNA抽出キットは、珪藻の珪質殻を破壊できないため、珪藻DNAの抽出に直接使用することは難しい場合が多い¹⁸。したがって、珪藻の殻を破壊することは、珪藻DNAを抽出する上で解決すべき重要な技術的問題の1つです。

同時に、法医学研究サンプルに含まれる珪藻の数は、水試料であろうと溺死体の臓器や組織であろうと、限られていることが多いため、珪藻を濃縮する必要があります。濃縮の本質は物質の分離です。珪藻をまとめようとするときは、他の材料成分(干渉成分)の含有量を最小限に抑えます。法医学研究では、実験室はしばしば遠心分離または膜ろ過濃縮法を使用して珪藻細胞を分離します¹⁹。しかし、真空ポンプ装置が広く使用されていないため、膜濃縮法は通常の一次法医学研究所ではあまり使用されていません。そのため、遠心分離法は、法医学研究所²⁰において依然として一般的に珪藻濃縮である。

珪藻からのDNA抽出は、現在、主に法医学の現場で使用されており、その適用には大きな制限があります。現在、法医学で使用される珪藻DNA抽出キットは市場に出回っており、一般的に高価です²¹。この記事では、改良された珪藻DNA抽出法を提供し、珪藻DNA抽出を簡単、便利、かつ費用対効果の高いものにします。これにより、その後の珪藻の分子生物学的検査の適用が増加し、珪藻検査を通じて法医学における溺死に関連する問題をよりよく解決することができます。珪藻の珪質細胞壁をガラスビーズで壊し、渦に適切な時間を設定する方法です。このようにして、プロテイナーゼKと結合溶液は細胞を急速に溶解し、細胞内のさまざまな酵素を不活性化します。ゲノムDNAは吸着カラムのマトリックス膜に吸収され、最終的に溶出バッファーによって溶出されます。このような改良された全血遺伝子抽出キットは、法医学検査材料における血液キットの珪藻DNA抽出効果を向上させ、法医学診療における珪藻DNA抽出のコストを削減し、草の根法医学研究によりよく適用することができる。

プロトコル

この研究は、海南医科大学の倫理委員会によって承認されました。この研究で使用された組織サンプルは、ヒトを対象とする研究とは見なされません。これらの標本は法医学的病理診断を目的として得られたもので、残りは今回の実験で珪藻DNAの抽出に用いられた。研究者は、関連する利害関係者からインフォームドコンセントを得るために、個人を簡単に特定することはできません。

注:この実験で報告された研究方法の一般的な適用性を確保するために、この実験は基本的に使用したキットの操作手順に従い、いくつかの手順のみを変更しました。この実験で使用した水サンプルは、実験室近くの池から無作為に採取しました(補足図1A)。この実験では、抽出プロトコルを実証するための研究組織として、溺死した遺体の肺組織が確認されました(補足図1B)。法医学の実践では、珪藻のDNAを抽出するために、溺死した遺体の他の臓器や組織(肝臓、脾臓、腎臓、骨髄など)を使用する必要がある場合もありますが、これには、実験の対応するセクションで説明するこの実験方法に対応するわずかな改善が必要です。この実験で使用された肺組織サンプルは、法医学事件で明らかに溺死した死体から採取されたものです。肺組織に珪藻が含まれていることを証明するために、形態学的試験が実施されています(補足図2)。

1. 試料の前処理

1. 水サンプルの前処理
   1. 10 mLの水サンプルを遠心チューブに入れ、13,400 x g で5分間遠心分離します。上清9.8mLをピペットガンで慎重に廃棄し、底部に残った濃縮珪藻水サンプル約200μLを2mLの遠心チューブに移します。
      注:最初に事前実験を行うことができ、10 mLの水サンプルが濃縮に十分でない場合は、初期量を増やすことができます。
2. 組織サンプルの前処理
   1. 溺死した体から肺縁組織0.5gを取り出し、肺組織が泥だらけになるまで完全に切り刻むか粉砕します。外因性珪藻の汚染を防ぐことは、このステップの中核です。はさみを使って繰り返しティッシュを細かく切ります。

2. DNA抽出

注:すべての遠心分離ステップは室温で完了します。14,500 x gの遠心力を持つ卓上遠心分離機を使用する。実験を開始する前に、70°Cに予熱したウォーターバス(または金属バス)を準備する必要があります。すべてのステップは、無菌操作の原則に厳密に従う必要があります。

1. 水サンプルと組織の組み立て
   注:水サンプルと組織珪藻DNA抽出法は同じです。
   1. 前処理水サンプルを含む2 mL遠心チューブにガラスビーズを加えます。10x-15xを反転させてよく混ぜます。添加されたガラスビーズは、大小のガラスビーズが1:1の質量比で混合されたものです。大きなガラスビーズの直径は1.5〜2.0 mm、小さなガラスビーズの直径は0.4〜0.6 mmです。
   2. 細かく刻んだ組織0.5gを取り、上記のように組織を含む2mL遠心分離管にガラスビーズを加えます。10x-15xを反転させて混ぜます。
2. 40 μLのプロテイナーゼK(20 mg/mL)をチューブに加えます。室温で15分間置き、この間、反転させ、3分ごとに10回混合します。
   注:組織が完全に消化されていない場合は、溶液が透明になるまでプロテイナーゼKの量を適切に増やすことができます。
3. 遠心チューブに結合緩衝液200μLを添加し、直ちにボルテックスし、4分間混合する(発振混合頻度:3000rpm)。
   注意: このステップでは、十分な混合強度と時間を確保するために、振とうの強度と時間を厳密に制御する必要があります。
4. 遠心分離管を70°Cのウォーターバスに10分間入れると、溶液が透明になります。
5. 100μLのイソプロパノールを遠心分離管に加え、ボルテックスして15秒間混合すると、この時点で凝集状の沈殿物が現れることがあります。
   注:上記の操作手順では、適切な強度でよく混合することが非常に重要ですが、DNAの剪断を防ぐために激しい振とうは避けてください。
6. 前の工程で得られた溶液を凝集剤沈殿物と一緒に吸着塔に入れます(吸着塔は収集チューブに入れられます)。吸着カラムの長さは3.0cm、直径は1.0cmで、吸着マトリックスはシリコンマトリックス膜です。
7. 8,000 x g で30秒間遠心分離し、廃液を回収管内に廃棄し、吸着塔を回収管に戻します。
8. 500 μLの阻害剤除去バッファーを吸着カラムに添加します。13,400 x g で30秒間遠心分離し、廃液を回収管に廃棄します。
9. 吸着カラムに700 μLの洗浄バッファーを加えます。13,400 x g で30秒間遠心分離し、廃液を回収管に廃棄します。
   注意: 最初に使用する前に、指定された量の無水エタノールを洗浄バッファーボトルに追加してください。
10. 500 μLの洗浄バッファーを吸着カラムに添加します。13,400 x g で30秒間遠心分離し、廃液を回収管に廃棄します。
11. 吸着カラムを空のコレクションチューブに戻します。14,500 x g で 2 分間遠心分離し、洗浄バッファー中の残留エタノールが下流の反応を阻害しないように、洗浄バッファーを可能な限り除去します。
12. 吸着カラムを取り出し、清潔な遠心分離管に入れます。100 μLの溶出バッファーを吸着膜の中央部に添加します。
13. 吸着カラムを室温で3〜5分間置き、13,400 x g で1分間遠心分離します。
14. 前のステップで得られた溶液を遠心吸着カラムに再度加えます。遠心吸着カラムを室温で2分間置き、13,400 x g で1分間遠心分離します。
    注:溶出バッファーは、70°Cのウォーターバスで約10分間予熱する必要があります。溶出量は50μL以上でなければなりません。そうしないと、DNA収量が減少します。
15. 抽出した珪藻DNAは、将来の使用のために2〜8°Cで保存してください。DNA溶液を長期間保存する場合は、-20°Cで保存してください。

3. PCR検査

注:法医学的サンプル中の珪藻の含有量は少ないことが多いため、溺死した遺体の組織サンプル抽出物には、独自のDNAを持つさまざまな程度の組織や臓器(この実験の肺など)が含まれている場合もあります。したがって、DNA抽出物中の全DNAの直接検出は、珪藻DNA抽出の状況を反映していません。この実験では、珪藻特異的プライマーを選択し、PCR産物を使用して抽出物中の珪藻DNA抽出を評価しました。生成物は、アガロースゲル電気泳動によって観察および分析することができ、また、より高い感度を有するリアルタイム蛍光定量PCR融解曲線によって分析することができます。

1. 水サンプルおよび組織から抽出したDNA2 μLをテンプレートとして添加します。検査方法は、以下の2つからお選びください。
2. 従来のPCR検査
   1. 珪藻18S rDNA断片を特異的に増幅できるプライ^マー22 を使用する。詳しくは、 表 1 を参照してください。
   2. プライマーの特性に応じたPCR反応系と増幅条件を確立します。詳しくは、 表 2 を参照してください。
   3. PCR増幅産物を2%アガロースゲルで泳動します。ゲルイメージャーでイメージングを観察し、分析します。
3. 蛍光定量PCR検査
   1. 珪藻18S rDNA断片を特異的に増幅できる上記のプライマーを使用して、リアルタイム蛍光定量PCR反応システムを調製します。詳しくは、 表 3 を参照してください。
   2. PCR増幅を行い、得られた増幅曲線とCt値を解析します。同時に、プログラムを設定し、増幅産物の二本鎖を蛍光定量PCR融解曲線技術により徐々に一本鎖に溶融し、得られた融解曲線を分析します。

結果

現在使用されているDNA抽出法で抽出されたDNA溶液は、サンプル中に異なるソースからのすべてのDNA成分を含んでいるため、このプロトコルによって得られたDNAも例外ではありませんでした。つまり、DNA溶液は単なる珪藻のゲノムDNAの溶液ではなかったのです。珪藻18S rDNA断片を特異的に増幅できるプライマーは、文献^22,23,24

ディスカッション

珪藻細胞は硬い珪質細胞壁¹⁷によって保護されており、珪藻DNAを抽出するにはこの構造を破壊する必要があります。通常のキットでは、珪藻の珪質殻を簡単に破壊することはできません。したがって、珪藻^DNA21の抽出に成功することは困難である。私たちの研究室では、最も一般的に使用されている血液DNA抽出キットを改良し、珪藻抽出の過程で異なる直径...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binding Buffer	BioTeke	B010006022	rapidly lysing cells
ChemoHS qPCR Mix	Monad	00007547-120506	qPCR Mix
D2000 DNA ladder	Real-Times(Beijing) Biotechnology	RTM415	Measure the position of electrophoretic bands
D512	Taihe Biotechnology	TW21109196	forword primer
D978	Taihe Biotechnology	TW21109197	reverse primer
Elution buffer	BioTeke	B010006022	A low-salt elution buffer washes off the DNA
Glass bead	Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)	70181000	Special glass beads for dispersing and grinding
Import adsorption column	BioTeke	B2008006022	Adsorption column with silica matrix membrane
Inhibitor Removal Buffer	BioTeke	B010006022	Removal of Inhibitors in DNA Extraction
Isopropanol	BioTeke	B010006022	Precipitate or isolate DNA
MIX-30S Mini Mixer	Miulab	MUC881206	oscillatory action
Proteinase K	BioTeke	B010006022	Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Rotor-Gene Q 5plex HRM	Qiagen	R1116175	real-time fluorescence quantification PCR
Speed Micro-Centrifuge	Scilogex	9013001121	centrifuge
Tanon 3500R Gel Imager	Tanon	16T5553R-455	gel imaging
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Thermo Cycler	Zhuhai Hema	VRB020A	ordinary PCR
Wash Buffer	BioTeke	B010006022	Remove impurities such as cell metabolites