水試料および組織からの珪藻DNAの抽出

要約

この記事は修正された共通のDNAの抽出のキットを使用して珪藻DNAの抽出のためのプロトコルを記述する。

要約

珪藻の検査は、死体が水中で溺死したかどうかを判断し、溺死した場所を推測するために、法医学の実践において不可欠な補助手段です。珪藻試験は、環境・プランクトンの分野においても重要な研究内容です。珪藻DNAを主な研究対象とする珪藻分子生物学的試験技術は、珪藻の新しい試験方法です。珪藻DNA抽出は、珪藻分子試験の基本です。現在、珪藻DNA抽出に一般的に使用されているキットは高価であり、関連する研究を実施するためのコストが増加します。私たちの研究室は、一般的な全血ゲノムDNA迅速抽出キットを改良し、満足のいく珪藻DNA抽出効果を得て、関連研究のためのガラスビーズに基づく代替の経済的で手頃な価格のDNA抽出ソリューションを提供しました。このプロトコルを使用して抽出された珪藻DNAは、PCRやシーケンシングなど、多くの下流アプリケーションを満たすことができます。

概要

法医学の実践では、水中で発見された死体が溺死したのか、それとも死後に水中に投げ込まれたのかを判断することは、事件¹の適切な解決に不可欠です。また、法医学の実践²において緊急に解決しなければならない難しい問題の1つでもあります。珪藻は自然環境(特に水中)に豊富に存在します^3,4。溺死の過程で、低酸素症とストレス反応により、人々は激しい呼吸運動をし、溺れる液体を大量に吸い込みます。したがって、水中の珪藻は溺れた液体とともに肺に入り、一部の珪藻は肺胞毛細血管関門を介して血液循環に入り、^{血流とともに}内臓に広がる可能性があります^5,6。肺、肝臓、骨髄などの内部組織や臓器で珪藻が検出されることは、死ぬ前に溺死したことを示す強力な証拠です^7,8。現在、法医学的珪藻試験は、主に形態学的試験方法に基づいています。組織の一連の前消化の後、未消化珪藻の形態学的定性的および定量的推定が顕微鏡下で行われる。この期間中は、硝酸などの危険で環境に優しくない試薬を使用する必要があります。このプロセスには時間がかかり、研究....

プロトコル

この研究は、海南医科大学の倫理委員会によって承認されました。この研究で使用された組織サンプルは、ヒトを対象とする研究とは見なされません。これらの標本は法医学的病理診断を目的として得られたもので、残りは今回の実験で珪藻DNAの抽出に用いられた。研究者は、関連する利害関係者からインフォームドコンセントを得るために、個人を簡単に特定することはできません。

注:この実験で報告された研究方法の一般的な適用性を確保するために、この実験は基本的に使用したキットの操作手順に従い、いくつかの手順のみを変更しました。この実験で使用した水サンプルは、実験室近くの池から無作為に採取しました(補足図1A)。この実験では、抽出プロトコルを実証するための研究組織として、溺死した遺体の肺組織が確認されました(補足図1B)。法医学の実践では、珪藻のDNAを抽出するために、溺死した遺体の他の臓器や組織(肝臓、脾臓、腎臓、骨髄など)を使用する必要がある場合もありますが、これには、実験の対応するセクションで説明するこの実験方法に対応するわずかな改善が必要です。この実験で使用された肺組織サンプルは、法医学事件で明らかに溺死した死体から採取されたものです。肺組織に珪藻が含まれていることを証明するために、形態学的試験が実施されています(補足図2)。

1.....

ディスカッション

珪藻細胞は硬い珪質細胞壁¹⁷によって保護されており、珪藻DNAを抽出するにはこの構造を破壊する必要があります。通常のキットでは、珪藻の珪質殻を簡単に破壊することはできません。したがって、珪藻^DNA21の抽出に成功することは困難である。私たちの研究室では、最も一般的に使用されている血液DNA抽出キットを改良し、珪藻抽出の過程で異なる直径.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binding Buffer	BioTeke	B010006022	rapidly lysing cells
ChemoHS qPCR Mix	Monad	00007547-120506	qPCR Mix
D2000 DNA ladder	Real-Times(Beijing) Biotechnology	RTM415	Measure the position of electrophoretic bands
D512	Taihe Biotechnology	TW21109196	forword primer
D978	Taihe Biotechnology	TW21109197	reverse primer
Elution buffer	BioTeke	B010006022	A low-salt elution buffer washes off the DNA
Glass bead	Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)	70181000	Special glass beads for dispersing and grinding
Import adsorption column	BioTeke	B2008006022	Adsorption column with silica matrix membrane
Inhibitor Removal Buffer	BioTeke	B010006022	Removal of Inhibitors in DNA Extraction
Isopropanol	BioTeke	B010006022	Precipitate or isolate DNA
MIX-30S Mini Mixer	Miulab	MUC881206	oscillatory action
Proteinase K	BioTeke	B010006022	Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Rotor-Gene Q 5plex HRM	Qiagen	R1116175	real-time fluorescence quantification PCR
Speed Micro-Centrifuge	Scilogex	9013001121	centrifuge
Tanon 3500R Gel Imager	Tanon	16T5553R-455	gel imaging
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Thermo Cycler	Zhuhai Hema	VRB020A	ordinary PCR
Wash Buffer	BioTeke	B010006022	Remove impurities such as cell metabolites