Extracción de ADN de diatomeas a partir de muestras de agua y tejidos

Resumen

Este artículo describe un protocolo para la extracción de ADN de diatomeas utilizando un kit de extracción de ADN común modificado.

Resumen

La prueba de diatomeas es un medio auxiliar esencial en la práctica forense para determinar si el cadáver se ahogó en el agua e inferir el lugar del ahogamiento. Las pruebas de diatomeas también son un importante contenido de investigación en el campo del medio ambiente y el plancton. La tecnología de pruebas de biología molecular de diatomeas, que se centra en el ADN de diatomeas como objeto de investigación principal, es un nuevo método de prueba de diatomeas. La extracción de ADN de diatomeas es la base de las pruebas moleculares de diatomeas. En la actualidad, los kits comúnmente utilizados para la extracción de ADN de diatomeas son costosos, lo que aumenta el costo de llevar a cabo investigaciones relacionadas. Nuestro laboratorio mejoró el kit general de extracción rápida de ADN genómico de sangre entera y obtuvo un efecto satisfactorio de extracción de ADN de diatomeas, proporcionando así una solución alternativa de extracción de ADN económica y asequible basada en perlas de vidrio para la investigación relacionada. El ADN de diatomeas extraído mediante este protocolo podría satisfacer muchas aplicaciones posteriores, como la PCR y la secuenciación.

Introducción

En la práctica forense, determinar si un cadáver encontrado en el agua ahogándose o fue arrojado al agua después de la muerte es esencial para la correcta resolución del caso¹. También es una de las cuestiones difíciles que deben resolverse con urgencia en la práctica forense². Las diatomeas son abundantes en el medio natural (especialmente en el agua)^3,4. En el proceso de ahogamiento, debido a la hipoxia y la respuesta al estrés, las personas tendrán movimientos respiratorios intensos e inhalarán una gran cantidad de líquido de ahogamiento. Por lo tanto, las diatomeas en el agua ingresan al pulmón con el líquido que se ahoga, y algunas diatomeas pueden ingresar a la circulación sanguínea a través de la barrera alveolar-capilar y extenderse a los órganos internos con el flujo sanguíneo ^5,6. La detección de diatomeas en tejidos y órganos internos como pulmón, hígado y médula ósea es una fuerte evidencia de ahogamiento antes de la muerte ^7,8. En la actualidad, las pruebas forenses de diatomeas se basan principalmente en métodos de pruebas morfológicas. Después de una serie de predigestión del tejido, las estimaciones morfológicas cualitativas y cuantitativas de las diatomeas no digeridas se llevan a cabo bajo el microscopio. Durante este período, es necesario utilizar reactivos peligrosos y poco respetuosos con el medio ambiente, como el ácido nítrico. Este proceso requiere mucho tiempo y requiere que los investigadores tengan sólidos conocimientos taxonómicos y una amplia experiencia. Todo esto conlleva ciertos desafíos para el personal forense⁹. La tecnología de prueba de ADN de diatomeas es una nueva tecnología para la prueba de diatomeas desarrollada en los últimos años 10,11,12. Esta tecnología realiza la identificación de especies de diatomeas mediante el análisis de la composición específica de la secuencia de ADN de las diatomeas^13,14. La tecnología de PCR y la tecnología de secuenciación son métodos técnicos comúnmente utilizados, pero su base es la extracción exitosa de ADN de diatomeas. Sin embargo, las diatomeas tienen una estructura especial diferente a la de otros organismos, lo que hace que sus técnicas de extracción de ADN también sean diferentes.

La pared celular de la diatomea tiene un alto grado de silicificación, y su componente principal es el dióxido de silicio 15,16,17. La pared celular silícea es muy dura y debe ser destruida antes de extraer el ADN. Los kits de extracción de ADN ordinarios suelen ser difíciles de utilizar directamente para la extracción de ADN de diatomeas porque no pueden destruir la capa silícea de diatomeas¹⁸. Por lo tanto, la destrucción de la capa silícea de las diatomeas es uno de los problemas técnicos clave a resolver en la extracción del ADN de diatomeas.

Al mismo tiempo, dado que el número de diatomeas contenidas en las muestras de investigación forense, ya sean muestras de agua u órganos y tejidos de cuerpos ahogados, suele ser limitado, es necesario enriquecer las diatomeas. La esencia del enriquecimiento es la separación de sustancias. Al tratar de juntar diatomeas, minimice el contenido de otros componentes materiales (componentes que interfieren). En el trabajo forense, los laboratorios a menudo utilizan métodos de enriquecimiento por centrifugación o filtración por membrana para separar las células de diatomeas¹⁹. Sin embargo, dado que el equipo de bombeo de vacío no se usa ampliamente, el método de enriquecimiento por membrana no se usa a menudo en los laboratorios forenses primarios ordinarios. Por lo tanto, el método de centrifugación sigue siendo comúnmente el enriquecimiento de diatomeas en los laboratorios forenses²⁰.

La extracción de ADN a partir de diatomeas se utiliza actualmente principalmente en la práctica forense, y existen importantes limitaciones para su aplicación. En la actualidad, existen pocos kits de extracción de ADN de diatomeas utilizados en la ciencia forense en el mercado y generalmente son caros²¹. Este artículo proporciona un método mejorado de extracción de ADN de diatomeas, lo que hace que la extracción de ADN de diatomeas sea simple, conveniente y rentable. Esto aumenta la aplicación de las pruebas posteriores de biología molecular de las diatomeas y puede resolver mejor los problemas relacionados con el ahogamiento en la medicina forense a través de las pruebas de diatomeas. Este método rompe las paredes celulares silíceas de las diatomeas mediante la adición de perlas de vidrio y el establecimiento de un tiempo apropiado para el vórtice. De esta manera, la proteinasa K y la solución de unión lisan rápidamente las células e inactivan varias enzimas en las células. El ADN genómico se absorbe en la membrana de la matriz en la columna de adsorción y finalmente es eluido por el tampón de elución. Un kit de extracción de genes de sangre total mejorado mejora el efecto de extracción de ADN de diatomeas del kit de sangre en materiales de examen forense, reduce el costo de la extracción de ADN de diatomeas en la práctica forense y se puede aplicar mejor a la investigación forense de base.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Hainan. Las muestras de tejido utilizadas en este estudio no se consideran estudios con seres humanos. Estos especímenes se obtuvieron con el propósito de realizar un diagnóstico patológico forense, y el resto se utilizó para la extracción de ADN de diatomeas en este experimento. Los investigadores no pueden identificar fácilmente a las personas para obtener el consentimiento informado de las partes interesadas pertinentes.

NOTA: Para garantizar la aplicabilidad general del método de investigación reportado en este experimento, este experimento siguió básicamente las instrucciones de operación del kit utilizado, y solo se modificaron algunos pasos. Las muestras de agua utilizadas en este experimento se tomaron aleatoriamente de estanques cercanos al laboratorio (Figura suplementaria 1A). En este experimento, se confirmó que el tejido pulmonar del cuerpo ahogado era el tejido de investigación para demostrar el protocolo de extracción (Figura suplementaria 1B). En la práctica forense, a veces también es necesario utilizar otros órganos y tejidos de cuerpos ahogados (como hígado, bazo, riñón, médula ósea, etc.) para extraer el ADN de diatomeas, lo que requiere pequeñas mejoras correspondientes a este método experimental, que se explicarán en la sección correspondiente del experimento. Las muestras de tejido pulmonar utilizadas en este experimento procedían de cadáveres que estaban claramente ahogados en casos forenses. Se han realizado pruebas morfológicas para demostrar que el tejido pulmonar contiene diatomeas (Figura complementaria 2).

1. Pretratamiento de las muestras

1. Pretratamiento de muestras de agua
   1. Tome 10 ml de muestra de agua en el tubo de la centrífuga y centrifugue a 13.400 x g durante 5 min. Deseche cuidadosamente 9,8 ml de sobrenadante con una pistola de pipetas y transfiera aproximadamente 200 μl de la muestra de agua de diatomeas enriquecida que queda en el fondo a un tubo de centrífuga de 2 ml.
      NOTA: El pre-experimento se puede llevar a cabo primero, y la cantidad inicial se puede aumentar si una muestra de agua de 10 ml no es suficiente para el enriquecimiento.
2. Pretratamiento de muestras de tejido
   1. Tome 0,5 g del tejido del margen pulmonar del cuerpo ahogado, pique o muela completamente el tejido pulmonar hasta que se vuelva fangoso. La prevención de la contaminación de diatomeas exógenas es el núcleo de este paso. Corta el pañuelo en pedazos repetidamente con unas tijeras.

2. Extracción de ADN

NOTA: Todos los pasos de centrifugación se completan a temperatura ambiente. Utilizando una centrífuga de sobremesa con una fuerza centrífuga de 14.500 x g; antes de comenzar el experimento es necesario preparar un baño de agua (o baño de metal) precalentado a 70 °C. Todos los pasos deben seguir estrictamente los principios de funcionamiento aséptico.

1. Ensamblaje de muestras de agua y tejidos
   NOTA: La muestra de agua y el método de extracción de ADN de diatomeas tisulares son los mismos.
   1. Agregue perlas de vidrio a un tubo de centrífuga de 2 ml que contenga la muestra de agua pretratada. Invierta 10x-15x para mezclar bien. Las perlas de vidrio añadidas se componen de perlas de vidrio grandes y pequeñas mezcladas en una proporción de masa de 1:1. El diámetro de las cuentas de vidrio grandes es de 1,5-2,0 mm y el de las cuentas de vidrio pequeñas es de 0,4-0,6 mm.
   2. Tome 0,5 g de pañuelo finamente picado, agregue perlas de vidrio a un tubo de centrífuga de 2 ml que contenga el tejido como se describió anteriormente. Invierta 10x-15x para mezclar.
2. Añadir 40 μL de proteinasa K (20 mg/mL) a las sondas. Coloque a temperatura ambiente durante 15 minutos, durante este período, invierta y mezcle 10 veces cada 3 minutos.
   NOTA: Si el tejido no se digiere completamente, la cantidad de proteinasa K se puede aumentar adecuadamente hasta que la solución se vuelva clara.
3. Añadir 200 μL de tampón de unión a los tubos de centrífuga, inmediatamente en vórtice, y mezclar durante 4 min (frecuencia de mezcla de oscilación: 3000 rpm).
   NOTA: En este paso, la intensidad y el tiempo de agitación deben controlarse estrictamente para garantizar una intensidad y un tiempo de mezcla suficientes.
4. Coloque los tubos de centrífuga en un baño de agua a 70 °C durante 10 minutos y la solución se vuelve clara.
5. Agregue 100 μL de isopropanol a los tubos de la centrífuga, vórtice y mezcle durante 15 s, puede aparecer precipitación de floculante en este momento.
   NOTA: Es muy importante mezclar bien con la fuerza adecuada en los pasos de operación anteriores, pero se debe evitar agitar vigorosamente para evitar el cizallamiento del ADN.
6. Coloque la solución obtenida en el paso anterior junto con el precipitado floculante en la columna de adsorción (la columna de adsorción se coloca en el tubo de recolección). La longitud de la columna de adsorción es de 3,0 cm, el diámetro es de 1,0 cm y la matriz de adsorción es una membrana de matriz de silicio.
7. Centrifugar a 8.000 x g durante 30 s, desechar el líquido residual en el tubo de recogida y volver a colocar la columna de adsorción en el tubo de recogida.
8. Añadir 500 μL de tampón de eliminación de inhibidores a la columna de adsorción. Centrifugar a 13.400 x g durante 30 s y desechar el líquido residual en el tubo de recogida.
9. Añadir 700 μL de tampón de lavado a la columna de adsorción. Centrifugar a 13.400 x g durante 30 s y desechar el líquido residual en el tubo de recogida.
   NOTA: Agregue la cantidad especificada de etanol absoluto a la botella de tampón de lavado antes del primer uso.
10. Añadir 500 μL de tampón de lavado a la columna de adsorción. Centrifugar a 13.400 x g durante 30 s y desechar el líquido residual en el tubo de recogida.
11. Vuelva a colocar la columna de adsorción en el tubo de recolección vacío. Centrifugar a 14.500 x g durante 2 minutos y retirar el tampón de lavado en la medida de lo posible, para evitar que el etanol residual en el tampón de lavado inhiba las reacciones posteriores.
12. Saque la columna de adsorción y colóquela en un tubo de centrífuga limpio. Añadir 100 μL de tampón de elución a la parte media de la membrana de adsorción.
13. Coloque la columna de adsorción a temperatura ambiente durante 3-5 minutos y centrifugue a 13.400 x g durante 1 minuto.
14. Añadir de nuevo la solución obtenida en el paso anterior a la columna de adsorción centrífuga. Coloque la columna de adsorción centrífuga a temperatura ambiente durante 2 minutos y centrifugue a 13.400 x g durante 1 minuto.
    NOTA: El tampón de elución debe precalentarse en un baño de agua a 70 °C durante unos 10 min. El volumen de elución no debe ser inferior a 50 μL; de lo contrario, el rendimiento de ADN se reducirá.
15. Almacene el ADN de diatomeas extraído a 2-8 °C para su uso futuro. Si la solución de ADN se va a almacenar durante mucho tiempo, guárdela a -20 °C.

3. Prueba PCR

NOTA: Dado que el contenido de diatomeas en las muestras forenses suele ser bajo, los extractos de muestras de tejido de los cuerpos ahogados también pueden contener diversos grados de tejido y órganos (como los pulmones en este experimento) con su propio ADN. Por lo tanto, la detección directa del ADN total en los extractos de ADN no refleja la situación de la extracción de ADN de diatomeas. En este experimento, se seleccionaron cebadores específicos para diatomeas y se utilizaron productos de PCR para evaluar la extracción de ADN de diatomeas en el extracto. Los productos se pueden observar y analizar mediante electroforesis en gel de agarosa y también se pueden analizar mediante una curva de fusión de PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real, que tiene una mayor sensibilidad.

1. Añadir 2 μL del ADN extraído de muestras de agua y tejidos como plantilla. Elija uno de los dos métodos siguientes para la inspección.
2. Prueba PCR convencional
   1. Utilice cebadores²² que puedan amplificar específicamente los fragmentos de ADNr de diatomeas 18S. Para obtener más información, consulte la Tabla 1.
   2. Establecer el sistema de reacción de PCR y las condiciones de amplificación de acuerdo con las características de los cebadores. Para obtener más información, consulte la Tabla 2.
   3. Ejecute los productos de amplificación de PCR en gel de agarosa al 2%. Observe y analice las imágenes con un generador de imágenes en gel.
3. Prueba PCR cuantitativa fluorescente
   1. Utilice los cebadores anteriores que pueden amplificar específicamente fragmentos de ADNr de diatomeas 18S para preparar un sistema de reacción de PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real. Para obtener más información, consulte la Tabla 3.
   2. Realizar la amplificación por PCR y analizar la curva de amplificación obtenida y los valores de Ct. Al mismo tiempo, establezca un programa, derrita las hebras dobles de los productos amplificados en hebras simples gradualmente a través de la tecnología de curva de fusión de PCR cuantitativa fluorescente y luego analice las curvas de fusión obtenidas.

Resultados

Dado que la solución de ADN extraída por el método de extracción de ADN utilizado actualmente contiene todos los componentes de ADN de diferentes fuentes en la muestra, el ADN obtenido por este protocolo no fue una excepción. Por lo tanto, la solución de ADN no era solo una solución de ADN genómico de diatomeas. Los cebadores que pueden amplificar específicamente los fragmentos de ADNr de diatomeas 18S fueron seleccionados mediante la consulta de la literatura 22,23,24.

Discusión

Las células de diatomeas están protegidas por paredes celulares silíceas duras¹⁷, y esta estructura debe ser destruida para extraer el ADN de diatomeas. Los kits ordinarios no destruyen fácilmente la cáscara silícea de las diatomeas; por lo tanto, es difícil extraer con éxito el ADN de diatomeas²¹. Nuestro laboratorio mejoró el kit de extracción de ADN sanguíneo más utilizado, añadiendo perlas de vidrio de diferentes diámetros y diferentes proporciones de masa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binding Buffer	BioTeke	B010006022	rapidly lysing cells
ChemoHS qPCR Mix	Monad	00007547-120506	qPCR Mix
D2000 DNA ladder	Real-Times(Beijing) Biotechnology	RTM415	Measure the position of electrophoretic bands
D512	Taihe Biotechnology	TW21109196	forword primer
D978	Taihe Biotechnology	TW21109197	reverse primer
Elution buffer	BioTeke	B010006022	A low-salt elution buffer washes off the DNA
Glass bead	Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)	70181000	Special glass beads for dispersing and grinding
Import adsorption column	BioTeke	B2008006022	Adsorption column with silica matrix membrane
Inhibitor Removal Buffer	BioTeke	B010006022	Removal of Inhibitors in DNA Extraction
Isopropanol	BioTeke	B010006022	Precipitate or isolate DNA
MIX-30S Mini Mixer	Miulab	MUC881206	oscillatory action
Proteinase K	BioTeke	B010006022	Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Rotor-Gene Q 5plex HRM	Qiagen	R1116175	real-time fluorescence quantification PCR
Speed Micro-Centrifuge	Scilogex	9013001121	centrifuge
Tanon 3500R Gel Imager	Tanon	16T5553R-455	gel imaging
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Thermo Cycler	Zhuhai Hema	VRB020A	ordinary PCR
Wash Buffer	BioTeke	B010006022	Remove impurities such as cell metabolites