Extraction de l’ADN des diatomées à partir d’échantillons d’eau et de tissus

Résumé

Cet article décrit un protocole d’extraction de l’ADN des diatomées à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN commun modifié.

Résumé

Le test des diatomées est un moyen auxiliaire essentiel dans la pratique médico-légale pour déterminer si le cadavre s’est noyé dans l’eau et pour déduire le lieu de la noyade. L’analyse des diatomées est également un élément de recherche important dans le domaine de l’environnement et du plancton. La technologie de test de biologie moléculaire des diatomées, qui se concentre sur l’ADN des diatomées en tant qu’objet de recherche principal, est une nouvelle méthode de test des diatomées. L’extraction de l’ADN des diatomées est la base des tests moléculaires des diatomées. À l’heure actuelle, les kits couramment utilisés pour l’extraction de l’ADN des diatomées sont coûteux, ce qui augmente le coût de la recherche connexe. Notre laboratoire a amélioré le kit général d’extraction rapide d’ADN génomique du sang total et a obtenu un effet d’extraction d’ADN de diatomée satisfaisant, fournissant ainsi une solution d’extraction d’ADN alternative économique et abordable à base de billes de verre pour la recherche connexe. L’ADN des diatomées extrait à l’aide de ce protocole pourrait satisfaire de nombreuses applications en aval, telles que la PCR et le séquençage.

Introduction

Dans la pratique médico-légale, il est essentiel de déterminer si un cadavre retrouvé dans l’eau en train de se noyer ou s’il a été jeté à l’eau après la mort est essentiel pour la bonne résolution de l’affaire¹. C’est aussi l’une des questions difficiles qui doivent être résolues de toute urgence dans la pratique médico-légale². Les diatomées sont abondantes dans le milieu naturel (en particulier dans l’eau)^3,4. Au cours du processus de noyade, en raison de l’hypoxie et de la réponse au stress, les gens auront des mouvements respiratoires intenses et inhaleront une grande quantité de liquide de noyade. Par conséquent, les diatomées dans l’eau pénètrent dans les poumons avec le liquide de noyade, et certaines diatomées peuvent pénétrer dans la circulation sanguine à travers la barrière alvéolaire-capillaire et se propager aux organes internes avec le flux sanguin ^5,6. La détection de diatomées dans les tissus internes et les organes tels que les poumons, le foie et la moelle osseuse est une preuve solide de noyade avant la mort ^7,8. À l’heure actuelle, les tests médico-légaux des diatomées sont principalement basés sur des méthodes de tests morphologiques. Après une série de pré-digestion des tissus, les estimations morphologiques qualitatives et quantitatives des diatomées non digérées sont effectuées au microscope. Pendant cette période, des réactifs dangereux et peu respectueux de l’environnement tels que l’acide nitrique doivent être utilisés. Ce processus prend beaucoup de temps et exige des chercheurs qu’ils disposent d’une solide expertise taxonomique et d’une vaste expérience. Tout cela pose certains défis au personnel médico-légal⁹. La technologie de test d’ADN des diatomées est une nouvelle technologie de test des diatomées développée ces dernières années 10,11,12. Cette technologie permet d’identifier les espèces de diatomées en analysant la composition spécifique des séquences d’ADN des diatomées^13,14. La technologie PCR et la technologie de séquençage sont des méthodes techniques couramment utilisées, mais leur base est l’extraction réussie de l’ADN des diatomées. Cependant, les diatomées ont une structure spéciale différente des autres organismes, ce qui rend leurs techniques d’extraction de l’ADN également différentes.

La paroi cellulaire de la diatomée a un degré élevé de silicification et son composant principal est le dioxyde de silicium 15,16,17. La paroi cellulaire siliceuse est très dure et doit être détruite avant d’extraire l’ADN. Les kits d’extraction d’ADN ordinaires sont souvent difficiles à utiliser directement pour l’extraction de l’ADN des diatomées car ils ne peuvent pas détruire la coquille siliceuse des diatomées¹⁸. Par conséquent, la destruction de la coquille siliceuse des diatomées est l’un des principaux problèmes techniques à résoudre dans l’extraction de l’ADN des diatomées.

Dans le même temps, étant donné que le nombre de diatomées contenues dans les échantillons de recherche médico-légale, qu’il s’agisse d’échantillons d’eau ou d’organes et de tissus de corps noyés, est souvent limité, il est nécessaire d’enrichir les diatomées. L’essence de l’enrichissement est la séparation des substances. Lorsque vous essayez de rassembler les diatomées, minimisez le contenu des autres composants matériels (composants interférents). Dans le domaine de la médecine légale, les laboratoires utilisent souvent des méthodes de centrifugation ou d’enrichissement par filtration membranaire pour séparer les cellules de diatomées¹⁹. Cependant, étant donné que l’équipement de pompage sous vide n’est pas largement utilisé, la méthode d’enrichissement membranaire n’est pas souvent utilisée dans les laboratoires médico-légaux primaires ordinaires. Ainsi, la méthode de centrifugation est encore couramment l’enrichissement en diatomées dans les laboratoires médico-légaux²⁰.

L’extraction de l’ADN à partir de diatomées est actuellement utilisée principalement dans la pratique médico-légale, et son application présente des limites importantes. À l’heure actuelle, il existe peu de kits d’extraction d’ADN de diatomées utilisés en médecine légale sur le marché et ils sont généralement coûteux²¹. Cet article fournit une méthode améliorée d’extraction de l’ADN des diatomées, rendant l’extraction de l’ADN des diatomées simple, pratique et rentable. Cela augmente l’application des tests de biologie moléculaire ultérieurs des diatomées et peut mieux résoudre les problèmes liés à la noyade en médecine légale grâce aux tests de diatomées. Cette méthode brise les parois cellulaires siliceuses des diatomées en ajoutant des billes de verre et en fixant un moment approprié pour le vortex. De cette façon, la protéinase K et la solution de liaison lysent rapidement les cellules et inactivent diverses enzymes dans les cellules. L’ADN génomique est absorbé dans la membrane matricielle de la colonne d’adsorption et finalement élué par le tampon d’élution. Un tel kit amélioré d’extraction de gènes de sang total améliore l’effet d’extraction de l’ADN des diatomées du kit de sang dans les matériaux d’examen médico-légal, réduit le coût de l’extraction de l’ADN des diatomées dans la pratique médico-légale et peut être mieux appliqué à la recherche médico-légale de base.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’Université de médecine de Hainan. Les échantillons de tissus utilisés dans cette étude ne sont pas considérés comme des études impliquant des sujets humains. Ces spécimens ont été obtenus à des fins de diagnostic de médecine légale, et le reste a été utilisé pour l’extraction de l’ADN des diatomées dans cette expérience. Les chercheurs ne peuvent pas facilement identifier les personnes pour obtenir le consentement éclairé des parties prenantes concernées.

REMARQUE : Pour assurer l’applicabilité générale de la méthode de recherche rapportée dans cette expérience, cette expérience a essentiellement suivi les instructions d’utilisation de la trousse utilisée, et seules certaines étapes ont été modifiées. Les échantillons d’eau utilisés dans cette expérience ont été prélevés au hasard dans des étangs situés à proximité du laboratoire (figure supplémentaire 1A). Dans cette expérience, il a été confirmé que le tissu pulmonaire du corps noyé était le tissu de recherche pour démontrer le protocole d’extraction (figure supplémentaire 1B). Dans la pratique médico-légale, il est parfois nécessaire d’utiliser d’autres organes et tissus de corps noyés (tels que le foie, la rate, les reins, la moelle osseuse, etc.) pour extraire l’ADN des diatomées, ce qui nécessite des améliorations mineures correspondantes de cette méthode expérimentale, qui seront expliquées dans la section correspondante de l’expérience. Les échantillons de tissus pulmonaires utilisés dans cette expérience provenaient de cadavres qui étaient clairement noyés dans des cas médico-légaux. Des tests morphologiques ont été effectués pour prouver que le tissu pulmonaire contient des diatomées (figure supplémentaire 2).

1. Prétraitement des échantillons

1. Prétraitement des échantillons d’eau
   1. Prélever 10 mL d’échantillon d’eau dans le tube à centrifuger et centrifuger à 13 400 x g pendant 5 min. Jeter délicatement 9,8 mL de surnageant à l’aide d’un pistolet à pipette et transférer environ 200 μL d’échantillon d’eau de diatomée enrichie restant au fond dans un tube à centrifuger de 2 mL.
      REMARQUE : Une expérience préliminaire peut être effectuée en premier, et la quantité initiale peut être augmentée si un échantillon d’eau de 10 ml n’est pas suffisant pour l’enrichissement.
2. Prétraitement d’échantillons de tissus
   1. Prélevez 0,5 g de tissu de bord pulmonaire du corps noyé, hachez ou broyez complètement le tissu pulmonaire jusqu’à ce qu’il devienne boueux. La prévention de la contamination des diatomées exogènes est au cœur de cette étape. Coupez le tissu en morceaux à plusieurs reprises à l’aide de ciseaux.

2. Extraction de l’ADN

REMARQUE : Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à température ambiante. Utilisation d’une centrifugeuse de bureau avec une force centrifuge de 14 500 x g ; un bain-marie (ou bain métallique) préchauffé à 70 °C doit être préparé avant le début de l’expérience. Toutes les étapes doivent suivre strictement les principes d’un fonctionnement aseptique.

1. Assemblage d’échantillons d’eau et de tissus
   REMARQUE : La méthode d’extraction de l’ADN des diatomées de l’échantillon d’eau et des tissus est la même.
   1. Ajouter les billes de verre dans un tube à centrifuger de 2 mL contenant l’échantillon d’eau prétraitée. Inversez 10x-15x pour bien mélanger. Les billes de verre ajoutées sont composées de grosses et de petites billes de verre mélangées dans un rapport de masse de 1 :1. Le diamètre des grosses perles de verre est de 1,5 à 2,0 mm et celui des petites perles de verre est de 0,4 à 0,6 mm.
   2. Prenez 0,5 g de tissu finement haché, ajoutez des billes de verre dans un tube à centrifuger de 2 ml contenant le tissu comme décrit ci-dessus. Inversez 10x-15x pour mélanger.
2. Ajouter 40 μL de protéinase K (20 mg/mL) dans les tubes. Placez à température ambiante pendant 15 min, pendant cette période, inversez et mélangez 10x toutes les 3 min.
   REMARQUE : Si le tissu n’est pas complètement digéré, la quantité de protéinase K peut être augmentée de manière appropriée jusqu’à ce que la solution devienne claire.
3. Ajouter 200 μL de tampon de liaison dans les tubes à centrifuger, immédiatement vortex, et mélanger pendant 4 min (fréquence de mélange d’oscillation : 3000 tr/min).
   REMARQUE : Dans cette étape, l’intensité et le temps d’agitation doivent être strictement contrôlés pour assurer une intensité et un temps de mélange suffisants.
4. Mettez les tubes à centrifuger dans un bain-marie à 70 °C pendant 10 min et la solution devient claire.
5. Ajouter 100 μL d’isopropanol dans les tubes à centrifuger, vortex et mélanger pendant 15 s, une précipitation floculante peut apparaître à ce moment-là.
   REMARQUE : Il est très important de bien mélanger avec une force appropriée dans les étapes d’opération ci-dessus, mais une agitation vigoureuse doit être évitée pour éviter le cisaillement de l’ADN.
6. Mettez la solution obtenue à l’étape précédente avec le précipité floculant dans la colonne d’adsorption (la colonne d’adsorption est placée dans le tube de collecte). La longueur de la colonne d’adsorption est de 3,0 cm, le diamètre est de 1,0 cm et la matrice d’adsorption est une membrane à matrice de silicium.
7. Centrifuger à 8 000 x g pendant 30 s, jeter le liquide usé dans le tube de collecte et remettre la colonne d’adsorption dans le tube de collecte.
8. Ajouter 500 μL de tampon d’élimination de l’inhibiteur dans la colonne d’adsorption. Centrifuger à 13 400 x g pendant 30 s et jeter le liquide usé dans le tube de collecte.
9. Ajouter 700 μL de tampon de lavage dans la colonne d’adsorption. Centrifuger à 13 400 x g pendant 30 s et jeter le liquide usé dans le tube de collecte.
   REMARQUE : Ajoutez la quantité spécifiée d’éthanol absolu dans la bouteille tampon de lavage avant la première utilisation.
10. Ajouter 500 μL de tampon de lavage dans la colonne d’adsorption. Centrifuger à 13 400 x g pendant 30 s et jeter le liquide usé dans le tube de collecte.
11. Remettez la colonne d’adsorption dans le tube de collecte vide. Centrifuger à 14 500 x g pendant 2 min et retirer autant que possible le tampon de lavage pour éviter que l’éthanol résiduel contenu dans le tampon de lavage n’inhibe les réactions en aval.
12. Retirez la colonne d’adsorption et placez-la dans un tube de centrifugation propre. Ajouter 100 μL de tampon d’élution dans la partie centrale de la membrane d’adsorption.
13. Placez la colonne d’adsorption à température ambiante pendant 3 à 5 minutes et centrifugez à 13 400 x g pendant 1 minute.
14. Ajouter à nouveau la solution obtenue à l’étape précédente dans la colonne d’adsorption centrifuge. Placez la colonne d’adsorption centrifuge à température ambiante pendant 2 min et la centrifugeuse à 13 400 x g pendant 1 min.
    REMARQUE : Le tampon d’élution doit être préchauffé dans un bain-marie à 70 °C pendant environ 10 minutes. Le volume d’élution ne doit pas être inférieur à 50 μL ; sinon, le rendement en ADN sera réduit.
15. Conservez l’ADN de la diatomée extrait à une température comprise entre 2 et 8 °C pour une utilisation ultérieure. Si la solution d’ADN doit être conservée pendant une longue période, conservez-la à -20 °C.

3. Test PCR

REMARQUE : Étant donné que la teneur en diatomées dans les échantillons médico-légaux est souvent faible, les extraits d’échantillons de tissus des corps noyés peuvent également contenir divers degrés de tissus et d’organes (tels que les poumons dans cette expérience) avec leur propre ADN. Par conséquent, la détection directe de l’ADN total dans les extraits d’ADN ne reflète pas la situation de l’extraction de l’ADN des diatomées. Dans cette expérience, des amorces spécifiques aux diatomées ont été sélectionnées et des produits de PCR ont été utilisés pour évaluer l’extraction de l’ADN des diatomées dans l’extrait. Les produits peuvent être observés et analysés par électrophorèse sur gel d’agarose et peuvent également être analysés par une courbe de fusion PCR quantitative fluorescente en temps réel, qui a une sensibilité plus élevée.

1. Ajouter 2 μL de l’ADN extrait d’échantillons d’eau et de tissus comme modèle. Choisissez l’une des deux méthodes d’inspection suivantes.
2. Test PCR conventionnel
   1. Utilisez des amorces²² qui peuvent amplifier spécifiquement les fragments d’ADNr de la diatomée 18S. Pour plus de détails, voir le tableau 1.
   2. Etablir le système de réaction PCR et les conditions d’amplification en fonction des caractéristiques des amorces. Pour plus de détails, voir le tableau 2.
   3. Exécuter les produits d’amplification PCR sur du gel d’agarose à 2%. Observez et analysez l’imagerie à l’aide d’un imageur à gel.
3. Test PCR quantitatif fluorescent
   1. Utilisez les amorces ci-dessus qui peuvent amplifier spécifiquement les fragments d’ADNr de la diatomée 18S pour préparer un système de réaction PCR quantitative fluorescente en temps réel. Pour plus de détails, voir le tableau 3.
   2. Effectuer l’amplification PCR et analyser la courbe d’amplification obtenue et les valeurs Ct. Dans le même temps, définissez un programme, faites fondre progressivement les doubles brins des produits amplifiés en monobrins grâce à la technologie de courbe de fusion PCR quantitative fluorescente, puis analysez les courbes de fusion obtenues.

Résultats

Étant donné que la solution d’ADN extraite par la méthode d’extraction d’ADN actuellement utilisée contient tous les composants de l’ADN provenant de différentes sources dans l’échantillon, l’ADN obtenu par ce protocole n’a pas fait exception. Ainsi, la solution d’ADN n’était pas seulement une solution d’ADN génomique de diatomées. Les amorces qui peuvent amplifier spécifiquement les fragments d’ADNr de la diatomée 18S ont été sélectionnées en consultant la littérature 22,23,24.

Discussion

Les cellules de diatomées sont protégées par des parois cellulaires siliceuses dures¹⁷, et cette structure doit être détruite pour extraire l’ADN des diatomées. Les kits ordinaires ne détruisent pas facilement la coquille siliceuse des diatomées ; il est donc difficile d’extraire avec succès l’ADN²¹ des diatomées. Notre laboratoire a amélioré le kit d’extraction d’ADN sanguin le plus couramment utilisé, en ajoutant des billes de verre de différents ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binding Buffer	BioTeke	B010006022	rapidly lysing cells
ChemoHS qPCR Mix	Monad	00007547-120506	qPCR Mix
D2000 DNA ladder	Real-Times(Beijing) Biotechnology	RTM415	Measure the position of electrophoretic bands
D512	Taihe Biotechnology	TW21109196	forword primer
D978	Taihe Biotechnology	TW21109197	reverse primer
Elution buffer	BioTeke	B010006022	A low-salt elution buffer washes off the DNA
Glass bead	Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)	70181000	Special glass beads for dispersing and grinding
Import adsorption column	BioTeke	B2008006022	Adsorption column with silica matrix membrane
Inhibitor Removal Buffer	BioTeke	B010006022	Removal of Inhibitors in DNA Extraction
Isopropanol	BioTeke	B010006022	Precipitate or isolate DNA
MIX-30S Mini Mixer	Miulab	MUC881206	oscillatory action
Proteinase K	BioTeke	B010006022	Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Rotor-Gene Q 5plex HRM	Qiagen	R1116175	real-time fluorescence quantification PCR
Speed Micro-Centrifuge	Scilogex	9013001121	centrifuge
Tanon 3500R Gel Imager	Tanon	16T5553R-455	gel imaging
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Thermo Cycler	Zhuhai Hema	VRB020A	ordinary PCR
Wash Buffer	BioTeke	B010006022	Remove impurities such as cell metabolites