استجواب تفاعلات الخلايا الخلوية في الغدة اللعابية عبر تصوير الخلايا الحية خارج الجسم الحي

Summary

التصوير المناعي الفلوري مقيد بالقدرة على مراقبة العمليات البيولوجية المعقدة التي تعتمد على الوقت في لقطة واحدة فقط في الوقت المناسب. تحدد هذه الدراسة نهج التصوير المباشر الذي تم إجراؤه على شرائح الغدة تحت الفك السفلي للفأر المقطوعة بدقة. يسمح هذا النهج بالمراقبة في الوقت الفعلي للتفاعلات بين الخلايا الخلوية أثناء الاتزان الداخلي وعمليات التجديد والإصلاح.

Abstract

تجديد الغدد اللعابية هو عملية معقدة تنطوي على تفاعلات معقدة بين أنواع الخلايا المختلفة. سلطت الدراسات الحديثة الضوء على الدور المحوري الذي تلعبه البلاعم في دفع الاستجابة المتجددة. ومع ذلك ، فقد اعتمد فهمنا لهذا الدور الحاسم في المقام الأول على وجهات النظر الثابتة التي تم الحصول عليها من خزعات الأنسجة الثابتة. للتغلب على هذا القيد واكتساب نظرة ثاقبة لهذه التفاعلات في الوقت الفعلي ، تحدد هذه الدراسة بروتوكولا شاملا لزراعة أنسجة الغدد اللعابية خارج الجسم الحي والتقاط صور حية لهجرة الخلايا.

يتضمن البروتوكول عدة خطوات رئيسية: أولا ، يتم تقطيع أنسجة الغدد اللعابية تحت الفك السفلي للفأر بعناية باستخدام اهتزاز ثم يتم زراعتها في واجهة الهواء والسائل. يمكن إصابة هذه الشرائح عمدا ، على سبيل المثال ، من خلال التعرض للإشعاع ، لإحداث تلف خلوي وتحفيز الاستجابة المتجددة. لتتبع خلايا معينة ذات أهمية ، يمكن تصنيفها داخليا ، مثل استخدام أنسجة الغدد اللعابية التي تم جمعها من الفئران المعدلة وراثيا حيث يتم تمييز بروتين معين ببروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الأجسام المضادة المقترنة بالفلورسنت لتلطيخ الخلايا التي تعبر عن علامات سطح خلية معينة ذات أهمية. بمجرد تحضيرها ، تخضع شرائح الغدد اللعابية للتصوير المباشر باستخدام نظام تصوير متحد البؤر عالي المحتوى على مدار 12 ساعة ، مع التقاط الصور كل 15 دقيقة. ثم يتم تجميع الصور الناتجة لإنشاء فيلم ، والذي يمكن تحليله لاحقا لاستخراج معلمات سلوك الخلية القيمة. توفر هذه الطريقة المبتكرة للباحثين أداة قوية للتحقيق في تفاعلات البلاعم داخل الغدة اللعابية بعد الإصابة وفهمها بشكل أفضل ، وبالتالي تعزيز معرفتنا بعمليات التجدد التي تلعب دورا في هذا السياق البيولوجي الديناميكي.

Introduction

لقد ثبت أن البلاعم تلعب أدوارا متزايدة الأهمية في عمليات التجديد والإصلاح ، وتمتد إلى ما وراء وظيفتها المناعية الكلاسيكية^1،2. في الواقع ، تشارك البلاعم في عدد كبير من العمليات المتعلقة بالتجديد ، وتظهر نشاطا تنظيميا حاسما في جميع مراحل الإصلاح ، بالإضافة إلى تكوين الندبة والتليف ^3,4. البلاعم المقيمة في الأنسجة هي أنواع خلايا غير متجانسة للغاية مع آليات معقدة تقود الأنماط الظاهرية الخلوية المتنوعة ، وتلعب أدوارا أساسية في تطور الأعضاء ووظيفتها وتوازنها (كما تمت مراجعته في⁵). تنشأ البلاعم المقيمة في الأنسجة في البداية من السلائف في كيس الصفار وكبد الجنين ، ويتم استبدالها لاحقا بالانتشار أو عن طريق وحيدات الدم المشتقة من نخاع العظام بمعدلات متفاوتة ، اعتمادا على طول عمر البلاعم الموجودة والأنسجة أو المكانة التي يقيمون فيها ^6,7.

الأهم من ذلك ، أن البلاعم المقيمة في الأنسجة منتشرة في جميع الأنسجة وتساهم في وظائف الأعضاء المتنوعة. يتم برمجتها بشكل فريد من خلال بيئتها الدقيقة لأداء وظائف متخصصة. لهذا السبب ، فإن توطين البلاعم داخل الأنسجة يوفر نظرة ثاقبة لوظيفتها ، مع وجود مجموعات فريدة لوحظت في الرئة والغدة الثديية والأمعاء والجلد والعضلات^8،9،10. أثناء نمو الغدة الثديية ، ترتبط الضامة الأقنية ارتباطا وثيقا بشجرة الأقنية ، ويؤدي استنزافها إلى انخفاض كبير في التفرع¹¹. علاوة على ذلك ، هناك حاجة إلى البلاعم للتشكل أثناء البلوغ والأسناخ في الحمل ، حيث يراقبون الظهارة بنشاط. في إصابة العضلات ، "تسكن" مجموعة معينة من البلاعم داخل موقع الإصابة ، مما يوفر مكانا عابرا توفر فيه الإشارات التي يسببها الانتشار اللازمة لتكاثر الخلايا الجذعية. وبالتالي ، فإنها تظهر الدور المتخصص لمجموعات البلاعم المتميزة في التحكم في عملية الإصلاح². في الرئة ، تحدث ظاهرة مماثلة حيث تقوم الضامة الخلالية بالخلايا السنخية من النوع الثاني (AT2) بتحويل الخلايا السنخية من النوع الثاني (AT2) للتعبير عن الإنترلوكين (IL) - R1 لتحويلها إلى أسلاف عابرة مرتبطة بالضرر من خلال إطلاق IL-1B¹². علاوة على ذلك ، أظهرت الأبحاث الحديثة أن البلاعم ضرورية لتجديد الغدة اللعابية تحت الفك السفلي للفأر (SMG) بعد إصابة التشعيع ، وفي غيابها ، يتعطل التجديد الظهاري¹³. مجتمعة ، تسلط هذه البيانات الضوء على أهمية تنشيط البلاعم ووظيفتها في المنافذ الالتهابية العابرة بعد إصابة الأنسجة ، وكذلك أثناء التوازن.

البلاعم هي خلايا نشطة ، وتتضمن وظائفها تفاعلات مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المختلفة ، بما في ذلك الاتصال المباشر بين الخلية^{والخلية 14,15} ، بالإضافة إلى المزيد من الطرق غير المباشرة مثل إفراز العوامل القابلة للذوبان ^2,16 ، والتي تعتبر ضرورية للتنظيم المتخصص. في حين أن التصوير المناعي الكلاسيكي مفيد للبدء في كشف هذه التفاعلات ، إلا أنه محدود من خلال تصوير لقطة واحدة فقط في الوقت المناسب ، وبالتالي حذف العديد من النقاط الزمنية الحاسمة لعملية تجديد ديناميكية للغاية^17,18. نظرا لأن أهمية التوقيت وظهور موجات مختلفة من التجديد أصبحت أكثر تركيزا ، فمن الضروري تشريح هذه العمليات بمزيد من التفصيل.

العلاج الإشعاعي هو علاج منقذ للحياة للعديد من الأشخاص المصابين بالسرطان. في حين أن العلاج الإشعاعي غالبا ما يكون فعالا في تقليص الورم (الأورام) أو القضاء عليه ، إلا أنه يمكن أن يتلف الأنسجة السليمة الموجودة في مجال الإشعاع ويثير استجابة مناعية. يمكن أن تؤدي الإصابة الإشعاعية إلى تجنيد البلاعم السريع ، والاستجابات المناعية المباشرة وغير المباشرة^19,20. غالبا ما يتم تشعيع الغدد اللعابية عن غير قصد أثناء علاج سرطان الرأس والرقبة^21,22 ، مما يؤدي إلى تلف الظهارة وضمور الخلايا والتليف^23,24 ، مما يؤدي إلى جفاف الفم أو جفاف الفم^{المزمن 25}.

تتكون الغدة اللعابية من عدد كبير من أنواع الخلايا وهياكلها ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الخلايا الظهارية (كل من الخلايا العنيبية المنتجة للعاب والخلايا الأقنية الناقلة للعاب) ، والخلايا الظهارية العضلية ، والخلايا السلفية الظهارية ، والأعصاب ، والأوعية الدموية ، والخلايا المناعية ، والخلايا الليفية ، والمصفوفة خارج الخلية (ECM). تم وصف دور واستجابة العديد من أنواع الخلايا هذه في الاستجابة التجديدية سابقا^{26،27،28،29،30}. ومع ذلك، فإن كيفية تفاعل هذه الخلايا المختلفة أثناء الاتزان الداخلي والتجدد، وخاصة سلوك الخلايا المناعية مثل الخلايا البلعمية الكبيرة، أقل دراسة. تصف هذه المخطوطة طريقة تم إنشاؤها حديثا لدراسة التفاعلات الحية بين الضامة الرشاشة والخلايا الأخرى ذات الأهمية في الأنسجة خارج الجسم الحي . يتم تقطيع SMG على اهتزاز ، ملطخة لعلامات السطح ، ويتم تصويرها لمدة تصل إلى 12 ساعة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن ملاحظة البلعمة للخلايا المحيطة بواسطة البلاعم ، ويمكن دراسة حركية هجرة البلاعم ، ويمكن إثبات التفاعلات المباشرة بين الخلايا الخلوية بين البلاعم والخلايا الظهارية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل وزارة الداخلية في المملكة المتحدة وتم تنفيذها بموجب PPLs PB5FC9BD2 و PP0330540. تتوافق جميع التجارب مع إرشادات REACH وإرشادات جامعة إدنبرة.

تم الحصول على الفئران البرية تجاريا (انظر جدول المواد). Krt14^{كريير ؛} تم تربية الفئران R26^mTmG في المنزل ، عن طريق عبور الفئران Krt14^{CreER / + 31} مع الفئران R26^{mTmG / mTmG 32}. في جميع التجارب ، تم استخدام إناث الفئران البالغة من العمر 8-10 أسابيع.

1. جمع وتضمين SMG

1. القتل الرحيم للفأر / الفئران عن طريق تعريضها لتركيز متزايد من ثاني أكسيد الكربون (CO₂). بعد ذلك ، قم برش منطقة الشق بنسبة 70٪ من الإيثانول (EtOH) واستخدم المقص والملقط لتشريح الرشاش (الرشاشات) بعناية من الأنسجة المحيطة (الشكل 1 أ). قم بإزالة أي دهون وأنسجة ضامة باستخدام الملقط ، وضع الغدة في أنبوب تجميع يحتوي على محلول ملح هانكس المتوازن المثلج (HBSS ، انظر جدول المواد).
2. افصل الغدة إلى قطع قياس حوالي 1 سم² لكل منها باستخدام ملقط.
3. سخني 4٪ أغاروز إلى 50 درجة مئوية ، ثم اسكبيه مباشرة في طبق 35 مم.
4. صب كمية صغيرة من الأغاروز المذاب 50 درجة مئوية في طبق منفصل وشطف الغدة جيدا عن طريق تحريكها في الأغاروز الزائد.
   ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لإزالة السوائل الزائدة من الغدد. فائض السوائل يمكن أن يمنع الغدد من الالتصاق بشكل صحيح بالأغاروز.
5. ضع 4-6 قطع من الغدة في الأغاروز ، مع التأكد من أنها مسطحة وتكون في نفس المستوى (الشكل 1 أ).
   ملاحظة: تأكد من أن الغدد لا تلمس سطح الآجار أو أسفل اللوحة.
6. ضع الغطاء على طبق 35 مم وانقله إلى صندوق ثلج ، وقم بتغطية اللوحة بالثلج.
7. انتظر لمدة 5-10 دقائق حتى يتجمد الأغاروز.

2. التقسيم

1. استخدم مشرطا لقطع بعناية حول كتلة الأغاروز المضمنة في الغدة ، وإزالة الكتلة التي تحتوي على الأنسجة من الطبق. اترك حدا بحجم 5 مم تقريبا.
2. قم بتوصيل كتلة الأغاروز بمرحلة الاهتزاز (انظر جدول المواد) عن طريق تطبيق قطرة من الغراء الفائق ، مما يضمن أن السطح السفلي للكتلة بالكامل ملامس للغراء الفائق.
3. اترك الغراء الفائق يتصلب لمدة 5 دقائق تقريبا. بعد ذلك ، املأ حجرة الاهتزاز بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج 1x (PBS) يحتوي على 1٪ بنسلين-ستربتومايسين (P / S).
4. أضف الثلج إلى كل من جانب وأسفل حجرة الاهتزاز.
   ملاحظة: حافظ على بيئة شديدة البرودة واستبدل الثلج حسب الحاجة.
5. تقليم أي أغاروز زائد وخلق فجوات 5 مم بين كل قطعة من الغدة عن طريق عمل شقوق بمشرط. هذا سوف ينتج شرائح فردية.
6. قم بمحاذاة شفرة الاهتزاز مع وجه كتلة الأغاروز واضبط نقطتي البداية والنهاية للأقسام لتحقيق سمك الشريحة المطلوب.
7. قبل البدء في عملية القطع ، تأكد من أن الشفرة ليست ملامسة للكتلة. سيمنع هذا الاحتياط قطع قطع كبيرة من الأغاروز عن طريق الخطأ وفقدان أجزاء من العينة.
8. قطع المقاطع بسمك 150 ميكرومتر بسرعة منخفضة واهتزاز عالي (على سبيل المثال ، سرعة 3 وإعداد اهتزاز من 8-10 على مقياس من 1-10 لكل معلمة) (الشكل 1 أ).
9. بمجرد قطع القسم وإطلاقه في PBS المحيط ، اجمع الأقسام باستخدام فرشاة الرسم وضعها في طبق يحتوي على وسائط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) الدافئة مسبقا مع P / S.

3. زراعة وتلطيخ شرائح SMG

1. زراعة
   1. أضف 1.5 مل من وسائط RPMI إلى كل بئر من لوحة 6 آبار تحتوي على مرشح 0.4 ميكرومتر. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء محاصرة أسفل الفلتر.
   2. انقل 1-6 شرائح إلى كل مرشح باستخدام فرشاة الرسم ، مع الحرص على عدم كسر الشرائح.
      ملاحظة: تأكد من أن الشرائح ليست مغمورة في الوسائط ولكن بدلا من ذلك تطفو على الفلتر. إذا كانت مغمورة بالكامل ، فقد تختنق أثناء الثقافة.
   3. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ ، وتغيير الوسائط كل 3 أيام (الشكل 1A).
   4. قم بتشعيع الألواح التجريبية بجرعة واحدة من إشعاع جاما 10 جراي باستخدام جهاز تشعيع متاح تجاريا (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، أعدهم إلى الحاضنة.
2. تلطيخ للتصوير الحي
   1. باستخدام فرشاة الرسم ، ارفع الشرائح برفق من المرشح وضعها في لوحة 24 بئرا تحتوي على 500 ميكرولتر من وسائط الاستزراع لكل بئر ، حيث سيتم غمر الشرائح.
   2. أضف الأجسام المضادة المترافقة ذات الصلة والبقعة النووية (انظر جدول المواد) إلى الوسائط بتركيزات مناسبة²⁷.
   3. احتضان الشرائح بالأجسام المضادة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية مع تحريض لطيف.
   4. اغسل الشرائح عن طريق غمرها في وسائط الثقافة وغسلها لمدة 3 جولات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع التقليب اللطيف.

4. تصاعد والتصوير الحي

1. باستخدام الملقط ، قم بإزالة الشريط من جانب واحد من فاصل التصوير على الوجهين وألصقه ، الجانب اللاصق لأسفل ، إلى أسفل لوحة زجاجية ذات 6 آبار.
2. ماصة 50 ميكرولتر من الوسائط في الفجوة الموجودة في وسط الفاصل.
3. ضع الشريحة في الوسائط باستخدام فرشاة الرسم ، وتأكد من أنها مسطحة دون أي فقاعات هواء محاصرة.
4. باستخدام ماصة ، قم بإزالة 20 ميكرولتر من الوسائط بعناية من الفجوة.
5. قم بإزالة الشريط من الجانب العلوي للفاصل باستخدام ملقط وضع غطاء دائري مقاس 25 مم في الأعلى. اضغط حول حافة الفاصل للتأكد من أن غطاء الغطاء متصل بإحكام ، مع الحرص على عدم كسر انزلاق الغطاء عن طريق استخدام الكثير من القوة (الشكل 1 أ).
6. تخيل الشريحة على مجهر متحد البؤر للفترة الزمنية أو الفترات الزمنية المطلوبة (على سبيل المثال ، كل 15 دقيقة لمدة 12 ساعة باستخدام هدف مائي 20x).

النتائج

لا تزال استجابة الضامة للإصابة في الغدة اللعابية تحت الفك السفلي غير معروفة. وهذا يشمل ما إذا كانت تتمركز وتهاجر إلى هياكل محددة داخل الغدة ، وكذلك المسافة والسرعة التي تهاجر بها. كان من الصعب تحديد ذلك من خلال أساليب التصوير الثابت.

لمعالجة هذا ، تم تطوير نهج التصوير الحي لدراسة تفاعل الخلايا الظهارية البلاعم في الوقت الفعلي. تم دمج تلطيخ الشرائح المناعي مع نموذج فأر تتبع النسب المسمى داخليا (الشكل 1 أ والشكل 2 أ). في هذا النموذج ، تعرضت الشرائح ل 10 Gy من تشعيع جاما للحث على إصابة التشعيع وتم تصويرها في 2 ساعة و 3 أيام و 4 أيام بعد التشعيع (IR) ، مع شرائح غير مشعة تعمل كعناصر تحكم. تم الحصول على البيانات من أربع قنوات: Hoechst (باستخدام الليزر 425 لتقليل السمية الضوئية) ، GFP (488) ، dTomato (561) ، و Alexa 647 (640). تم إجراء مكدس z ، وتم التقاط صورة كل 2-3 ميكرومتر ، مع جمع ما مجموعه 30 إلى 40 طائرة ، مما أدى إلى ارتفاع إجمالي يتراوح بين 80 و 90 ميكرومتر.

باستخدام هذه التقنية وتحليل إشارة الطماطم المرتبطة بالغشاء (mT) ونشاط Caspase3 / 7 ، أصبح من الواضح أن شرائح النمط العضوي احتفظت بهيكلها الظهاري ، ونجت في الثقافة ، وأظهرت الحد الأدنى من موت الخلايا. أظهرت البيانات أن الشرائح غير المشععة من الغدة تحت الفك السفلي من الفئران R26^{mTmG 32} ، المستزرعة لمدة 7 أيام ، احتفظت بإشارة mT والبنية الظهارية (الشكل 1B). ومع ذلك ، في 3 أيام بعد التشعيع خارج الجسم الحي ، كان ضمور الخلايا العنيبية والقنوية واضحا (الشكل 1 ب ؛ هياكل العنيبات والأقنية التي أبرزتها خطوط بيضاء وخضراء متقطعة ، على التوالي) ، بما يتفق مع إصابة الإشعاع في الجسم الحي ¹³. كان موت الخلايا المبرمج ضئيلا في الشرائح غير المشععة ، ولكن كان هناك دليل على وجود خلايا Caspase 3/7⁺ في الشرائح المشععة في 4 أيام بعد التشعيع (الشكل 1C ؛ الأسهم الخضراء) ، على غرار الإصابة في الجسم الحي ^33,34. علاوة على ذلك ، فإن الشرائح المشععة تلخص تلف الحمض النووي في الجسم الحي ^{34،35،36،37} ، كما هو موضح في ارتفاع γH2AX³⁸ مقارنة بالضوابط غير المشععة (الشكل 1D ، E). وهكذا ، أظهرت شرائح الغدد اللعابية ذات النمط العضوي قابلية جيدة للحياة في الثقافة واستجابت بشكل مشابه للأنسجة في الجسم الحي للتشعيع.

بعد ذلك ، تم التحقيق في تفاعلات الخلايا الخلوية في الوقت الفعلي. لوحظت البلاعم التي تتفاعل مباشرة مع الخلايا السلفية الظهارية التي تحمل علامة GFP (Krt14^CreER-GFP) على مدى فترة زمنية مدتها 12 ساعة في 3 أيام بعد الأشعة تحت الحمراء (الشكل 2A والفيديو 1). ومن اللافت للنظر أنه كان من الواضح أن البلاعم ظلت على مقربة من الخلايا السلفية الظهارية لساعات ، وغالبا ما بقيت على اتصال طوال فترة التصوير البالغة 12 ساعة. علاوة على ذلك ، لوحظ البلعمة في الوقت الحقيقي للخلايا الظهارية بواسطة البلاعم ، مما يؤكد أن البلاعم تؤدي وظيفتها التقليدية في نموذج زراعة الشرائح (الشكل 2B ومقاطع الفيديو 2 والفيديو 3). حددت هذه التقنية أيضا أن البلاعم ثابتة نسبيا أثناء كل من الاتزان الداخلي وبعد الإصابة بالإشعاع ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى كثافتها العالية داخل الأنسجة. يوضح هذا ، لأول مرة ، أن بلاعم الغدد اللعابية لا تهاجر على نطاق واسع أثناء الاتزان الداخلي أو بعد الإصابة بالتشعيع. ومع ذلك ، في حين أن البلاعم لم تظهر هجرة كبيرة ، أظهرت الأنسجة المحيطة ديناميكيات متزايدة بعد التشعيع ، مع تفاعل الضامة المتعددة بنشاط حول مجموعات من الخلايا الظهارية الموصوفة. بالإضافة إلى ذلك ، استنادا إلى التلوين النووي فقط ، سمحت لنا هذه التقنية بتصور حركة الخلية داخل الشريحة بمرور الوقت ، غالبا مع ظهور قنوات كاملة "تهاجر" داخل الأنسجة (الفيديو 4). بمرور الوقت أثناء عملية الاستزراع ، أصبح من الواضح أن الشرائح تحولت من شكل مسطح إلى مورفولوجيا تشبه الكرة ، مما يشير إلى أن حركة الخلية داخل الشريحة من المحتمل أن تكون بسبب إعادة ترتيبها في بنية تشبه الكرة ، تشبه حدث إعادة التنظيم المحتمل.

أخيرا ، يمكن استخدام بيانات التصوير الحية الناتجة عن هذا الفحص لقياس سلوك الخلية كميا ، مثل الهجرة. يمكن اكتشاف الخلايا الفردية وتجزئتها (الشكل 3 أ) ، ويمكن قياس الهجرة باستخدام برنامج تصوير وتحليل متاح تجاريا (انظر جدول المواد والفيديو 5). علاوة على ذلك ، يمكن إجراء أقرب تحليل للكائن لتحديد ما إذا كانت الخلايا ، في هذه الحالة ، البلاعم ، تهاجر بالقرب من الخلايا الأخرى ذات الأهمية ، في هذه الحالة ، خلايا Krt14^{CreER-GFP +} ، وكيف تتغير هذه الديناميكية بمرور الوقت (الشكل 3B).

الشكل 1: تلخيص الاستجابة في الجسم الحي في شرائح أنسجة الغدد اللعابية المقطوعة بدقة. (أ) رسم تخطيطي للبروتوكول التجريبي. (ب) صور تمثيلية للطماطم المرتبطة بالغشاء التي تم الحصول عليها من أنسجة الغدة تحت الفك السفلي الطازجة (SMG) ، أو شرائح SMG غير المعالجة المزروعة لمدة 7 أيام ، أو شرائح SMG المشععة بجرعة واحدة من 10 Gy أشعة جاما قبل 3 أو 7 أيام. تشير الخطوط البيضاء المتقطعة إلى أمثلة الهياكل acinar ، وتشير الخطوط الخضراء المتقطعة إلى أمثلة الهياكل القنية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (C) صور تمثيلية لتعبير Caspase-3/7 تم الحصول عليها من شرائح SMG غير المعالجة أو شرائح SMG المشععة بجرعة واحدة من 10 Gy أشعة جاما قبل 2 ساعة أو 4 أيام. تشير رؤوس الأسهم الخضراء إلى نوى موجبة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (د) صور تمثيلية لتعبير γH2AX تم الحصول عليها من شرائح SMG غير المعالجة أو شرائح SMG المشععة بجرعة واحدة من إشعاع جاما 10 Gy قبل 3 أيام. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (E) التعبير التمثيلي ل γH2AX في الخلايا الظهارية EpCAM ⁺ من شرائح SMG غير المعالجة أو شرائح SMG المشععة بجرعة واحدة من 10 Gy تشعيع جاما قبل 2 ساعة و 3 أيام. SSA = منطقة التشتت الجانبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التصوير الحي للتداخلات بين الخلايا الطلائية والبلعمة البلعمية. (أ) صور ثابتة متسلسلة للتفاعلات بين الخلايا السلفية KRT14+ وذريتها (خلايا Krt14^{CreER-GFP +}) والبلاعم بعد التشعيع. يلتقط التصوير الخلوي الحي الديناميكيات الخلوية على مدار 90 دقيقة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الفيديو المرتبط هو الفيديو 1. (ب) صور ثابتة متسلسلة لخلية بلاعمية تبتلع خلية طلائية. يظهر التصوير الخلوي الحي العملية على مدى 60 دقيقة. تشير الأسهم البيضاء إلى البلاعم ، وتشير الأسهم الصفراء إلى نواة الخلية التي تمر بالبلعمة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الفيديو المرتبط هو الفيديو 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: التصوير الحي لتحليل الديناميات الخلوية. (أ) صورة توضح تحديد الخلايا الفردية وتجزئتها لتحليل معلمات السلوك الخلوي، مثل الهجرة (انظر الفيديو 5). الخلايا شبه ملونة بشكل عشوائي للخلية الفردية وتمييز المسار. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (B) تحديد المسافة (بالميكرومتر) لأقرب كائن إلى خلايا Krt14^{CreER-GFP +} الفردية المرسومة على مدى 10 نقاط زمنية (الصور الملتقطة كل 5 دقائق). البيانات المقدمة كمتوسط القيمة لكل بئر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1: تصوير حي يكشف عن تفاعلات ديناميكية بين الخلايا السلفية KRT14 + / النسل والبلاعم بعد التشعيع. تعرضت الشرائح لجرعة واحدة من تشعيع جاما 10 جراي قبل التصوير الحي. يتم تمثيل خلايا Krt14^{CreER-GFP +} باللون الأخضر ، والبلاعم (F4 / 80+) باللون الأحمر ، والنوى باللون السماوي. يتكون الفيديو من مكدس z واحد ، يمتد على فترة ثقافة مدتها 12 ساعة مع التقاط الصور كل 15 دقيقة. الرجاء الضغط هنا لتحميل الفيديو.

فيديو 2: تصوير حي يلتقط البلاعم التي تبتلع خلية ظهارية. تظهر البلاعم (F4 / 80+) باللون الأحمر ، وتظهر النوى باللون السماوي. يتكون الفيديو من مكدس z واحد ويمتد على فترة ثقافة مدتها 12 ساعة مع التقاط الصور كل 15 دقيقة.يرجى النقر هنا لتنزيل الفيديو.

فيديو 3: أقصى تصوير حي للإسقاط يظهر بلاعم تبتلع خلية ظهارية. يتم عرض البلاعم (F4 / 80+) باللون الأحمر ، وتظهر النوى باللون السماوي. يتميز الفيديو بحد أقصى لعرض صور z-stack يبلغ مجموعها 80 ميكرومتر (يتم تقديم مستوى واحد في الفيديو 2) ويمتد على فترة استزراع مدتها 12 ساعة مع التقاط الصور كل 15 دقيقة.يرجى النقر هنا لتنزيل الفيديو.

فيديو 4: تصوير حي يوضح السلوك الديناميكي لظهارة الغدد اللعابية في الثقافة بعد التشعيع. تعرضت الشرائح لجرعة واحدة من تشعيع غاما 10 غراي قبل التصوير الحي. يتم تمثيل البلاعم (F4 / 80+) باللون الأحمر ، والنوى باللون السماوي. يتكون الفيديو من مكدس z واحد ، يمتد على فترة ثقافة مدتها 12 ساعة مع التقاط الصور كل 15 دقيقة.يرجى النقر هنا لتنزيل الفيديو.

فيديو 5: تتبع ترحيل الخلايا الكمي بمرور الوقت. يوضح هذا الفيديو التتبع الفردي لمسارات الخلايا من مقاطع فيديو التصوير المباشر. تشير الأسهم إلى مسارات الخلايا ، وتكون الخلايا شبه ملونة بشكل فردي. يتكون الفيديو من مكدس z واحد ويمتد على فترة ثقافة 1 ساعة مع التقاط الصور كل 15 دقيقة.الرجاء النقر هنا لتنزيل الفيديو.

Discussion

تقدم القدرة على زراعة أنسجة الغدد اللعابية خارج الجسم الحي فرصة ممتازة لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية في سياق كل من التوازن والاستجابة للإصابة. على الرغم من أن التصوير داخل الجسم للغدة تحت الفك السفلي للفأر ممكن^39,40 ، إلا أن هذه التقنية تعتمد على استخدام نماذج الفئران المراسل الفلورية لتسمية الخلايا ذات الأهمية داخليا ويجب إجراؤها تحت التخدير النهائي. هنا ، يتم وصف طريقة لزراعة شرائح الغدة تحت الفك السفلي خارج الجسم الحي ، والحفاظ على البنية الخلوية والتفاعلات بين الخلايا والخلايا. يعمل هذا النهج على تحسين تقنيات التصوير الحي الحالية ويوفر بديلا للتصوير داخل الجسم.

تعتمد صيانة الأنسجة على المدى الطويل باستخدام هذه التقنية على زراعة الشرائح في واجهة الهواء والسائل. من المحتمل أن تكون نماذج explant السابقة^26,41 قد حققت ثقافة ناجحة لبضعة أيام فقط لأنها كانت مغمورة في وسائل الإعلام و "مخنوقة" بشكل أساسي. في المقابل ، يحافظ استخدام نظام ثقافة واجهة الهواء السائل على صحة الأنسجة وهيكلها لفترة طويلة ، مما يضمن تصويرا عالي الجودة. تعد طريقة تركيب شرائح SMG قبل التصوير ، مع كمية صغيرة من الوسائط وداخل غرفة محدودة المساحة للحفاظ على الشريحة مسطحة ، جزءا لا يتجزأ من نجاح التقنية. يعتمد تصور الخلايا في هذا الفحص على الفئران المراسلة المصنفة داخليا أو الأجسام المضادة المترافقة بالفلورسنت. إن وفرة نماذج الفئران المراسل الفلورية المعدلة وراثيا والأجسام المضادة المترافقة التي تستهدف أنواعا معينة من الخلايا ومجموعات فرعية تجعل هذه الطريقة مناسبة لاستكشاف التفاعلات المختلفة الخاصة بالخلايا.

في حين أن هذه الطريقة توفر نموذجا جيدا للأنسجة في الموقع وتؤدي الإصابة بالإشعاع خارج الجسم الحي إلى ضمور البنية العنيبية والقنوية ، على غرار ما يحدث في الجسم الحي¹³ ، لا يمكن تلخيص بعض العناصر خارج الجسم الحي. وتشمل هذه عدم وجود الأوعية الدموية العاملة والمدخلات العصبية ، فضلا عن عدم وجود خلايا التهابية متسللة. بالنظر إلى الدور الموثق جيدا للأوعية الدموية والأعصاب في توازن الغدد اللعابية وتجديدها^26,42 وأهمية الخلايا المناعية المهاجرة⁴³ ، مثل الخلايا التائية والبائية ، في وظيفة الغدد اللعابية ، والاستجابة للإصابة ، والعدوى ، والتسبب في متلازمة سجوجرن (SS) (كما تمت مراجعته في⁴⁴) ، قد يفوت هذا الفحص بعض التفاعلات الخلوية المهمة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم تفويت أحداث الهجرة السريعة جدا ، مثل الخلية القاتلة الطبيعية (NK)⁴⁵ وحركة الخلايا المتغصنة (DC) ⁴⁶ ، عن طريق التصوير كل 15 دقيقة. ومع ذلك ، يمكن تحسين فترات التصوير لدراسة تفاعلات الخلايا والخلايا المحددة ذات الأهمية ، والقدرة على التصوير في 3 أبعاد من خلال z-stacks تسمح بتقييم حركة الخلايا ثلاثية الأبعاد. يعد تركيب الأنسجة بشكل آمن أثناء التصوير أمرا بالغ الأهمية للقياس الكمي ، مثل قياسات تتبع الخلايا. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن هذه الدراسة استخدمت أنسجة الفئران ، إلا أن البروتوكول يوفر طريقة قابلة للتطبيق لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية في الغدد اللعابية البشرية ، مما يولد معلومات متعدية قيمة لا يمكن الوصول إليها من خلال طرق أخرى.

في حين أن دور البلاعم المقيمة في الأنسجة في التوازن والتجديد قد تم إثباته في العديد من الأنسجة^{2،10،11،12} ، فإن دورها في الغدد اللعابية لا يزال دون إجابة إلى حد كبير. على الرغم من أنه من المعروف أن البلاعم ضرورية لتجديد الظهارة بعد إصابة التشعيع¹³ ، إلا أن الآليات الدقيقة الكامنة وراء هذا التأثير لا تزال غير معروفة. يتيح التصوير المباشر لشرائح الغدد اللعابية التصور في الوقت الفعلي وتحليل ديناميكيات الأنسجة المعقدة ، والتي غالبا ما يفوتها التصوير التقليدي متحد البؤر. بالإضافة إلى ذلك ، من الواضح أن البلاعم تخضع لتغييرات ديناميكية في الشكل أثناء أداء وظائف مختلفة في الجسم الحي^47،48،49 ، ومن المحتمل أن يوفر هذا البروتوكول تمثيلا أفضل لهذه التغييرات من عرض ثابت نموذجي في الأنسجة الثابتة. يمكن للدراسات المستقبلية استخدام هذه التقنية للتحقق من كيفية تغير اتصال الخلية الخلوية عبر مسار التوازن والإصابة والتجديد / الحل. سيكون هذا النهج مفيدا لتوضيح مسارات الإشارات الرئيسية والأحداث التي قد تقدم في النهاية فوائد علاجية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 µm filter cell culture inserts (Nunc)	Avantor/VWR	734-2240	Inserts pre-packed in 6-well multidishes, 20 mm × 25 mm
24 well plate	Corning	3524
35 mm dish	Falcon	353001
6 well plate	Corning	3516
Coverslips	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	111650	Deckglaser Cover Glasses 25 mm diameter
Double-sided sticker	Grace Bio-Labs	654004	SecureSeal Imaging Spacers SS1 x 13, 13 mm diameter x 0.12 mm depth, 25 mm x 25mm OD
EtOH	Scientific Laboratories Supplies	CHE1924	Absolute ethanol (EtOH) AR, 99.7%
F4/80 antibody	Invitrogen	17-4801-82	F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), APC, eBioscience
Forceps	Fine Science Tools	91113-10	Student Fine Forceps Straight Broad Shanks
Glass bottom 6 well plate	Cellvis	P06-1.5H-N	6 well glass bottom plate with high performance #1.5 cover glass
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Life Technologies	14025050	+calcium +magnesium, no phenol red
Hoechst	Sigma Aldrich	14533	Alternative name: bisBenzimide H 33342 trihydrochloride
Ice box	Fisher Scientific	11339623	Azlon Polyurethane Ice Buckets with Lid
Imaging and analysis software	Harmony
Low Melting Agarose	Merck	A9414-25G
Paintbrush			Watercolour brush, 10 mm x 2mm tip
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Life Technologies	20012027
RPMI	ThermoFisher	12634010	Gibco Advanced DMEM/F-12
Scalpel	Swann-Morton		Disposable scalpels, No. 11 blade
Scissors	Fine Science Tools	14088-10	Extra Narrow Scissors 10.5 cm
Shepherd Mark-I-68A 137Cs irradiator	JL Shepherd & Associates
Superglue	Bostik		Multi-purpose superglue, fast setting, ultra strong
Vibratome	Leica		Leica VT 1000 S
Vibratome blades	Astra		Superior Platinum Double Edge blade
Wild-type (C57BL/BJ) mice	Charles River