Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats Représentatifs
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

L’imagerie par immunofluorescence est limitée par la capacité d’observer des processus biologiques complexes et dépendants du temps en un seul instantané dans le temps. Cette étude décrit une approche d’imagerie en direct menée sur des coupes de glandes sous-maxillaires de souris découpées avec précision. Cette approche permet d’observer en temps réel les interactions cellule-cellule au cours de l’homéostasie et des processus de régénération et de réparation.

Résumé

La régénération des glandes salivaires est un processus complexe impliquant des interactions complexes entre divers types de cellules. Des études récentes ont mis en lumière le rôle central joué par les macrophages dans la réponse régénérative. Cependant, notre compréhension de ce rôle essentiel repose principalement sur des vues statiques obtenues à partir de biopsies tissulaires fixes. Pour surmonter cette limitation et mieux comprendre ces interactions en temps réel, cette étude décrit un protocole complet pour la culture ex vivo de tissus des glandes salivaires et la capture d’images en direct de la migration cellulaire.

Le protocole comporte plusieurs étapes clés : Tout d’abord, le tissu des glandes salivaires sous-maxillaires de souris est soigneusement tranché à l’aide d’un vibratome, puis cultivé à l’interface air-liquide. Ces tranches peuvent être intentionnellement blessées, par exemple par l’exposition à des radiations, pour induire des dommages cellulaires et déclencher la réponse régénératrice. Pour suivre des cellules d’intérêt spécifiques, elles peuvent être marquées de manière endogène, par exemple en utilisant des tissus de glandes salivaires prélevés sur des souris génétiquement modifiées où une protéine particulière est marquée par une protéine fluorescente verte (GFP). Alternativement, des anticorps conjugués par fluorescence peuvent être utilisés pour colorer les cellules exprimant des marqueurs spécifiques de surface cellulaire d’intérêt. Une fois préparées, les coupes de glandes salivaires sont soumises à une imagerie en direct à l’aide d’un système d’imagerie confocale à haut contenu sur une durée de 12 h, avec des images capturées à des intervalles de 15 minutes. Les images résultantes sont ensuite compilées pour créer un film, qui peut ensuite être analysé pour extraire de précieux paramètres de comportement cellulaire. Cette méthode novatrice fournit aux chercheurs un outil puissant pour étudier et mieux comprendre les interactions des macrophages au sein de la glande salivaire à la suite d’une lésion, faisant ainsi progresser nos connaissances sur les processus de régénération en jeu dans ce contexte biologique dynamique.

Introduction

Il a été démontré que les macrophages jouent un rôle de plus en plus important dans les processus de régénération et de réparation, au-delà de leur fonction immunitaire classique 1,2. En effet, les macrophages sont impliqués dans une pléthore de processus liés à la régénération, présentant une activité régulatrice critique à tous les stades de la réparation, ainsi que de la formation de cicatrices et de la fibrose 3,4. Les macrophages résidant dans les tissus sont des types de cellules très hétérogènes avec des mécanismes complexes à l’origine de divers phénotypes cellulaires, et ils jouent un rôle essentiel dans le développement, la fonction et l’homéostasie des organes (voiren 5). Les macrophages résidant dans les tissus proviennent initialement de précurseurs dans le sac vitellin et le foie du fœtus, et ils sont ensuite remplacés par la prolifération ou par des monocytes sanguins dérivés de la moelle osseuse à des rythmes variables, en fonction de la longévité des macrophages existants et du tissu ou de la niche dans laquelle ils résident 6,7.

Il est important de noter que les macrophages résidents dans les tissus sont dispersés dans tous les tissus et contribuent à diverses fonctions organiques. Ils sont programmés de manière unique par leur microenvironnement pour exécuter des fonctions spécifiques à une niche. Pour cette raison, la localisation des macrophages dans les tissus permet de mieux comprendre leur fonction, avec des populations uniques observées dans les poumons, la glande mammaire, l’intestin, la peau et les muscles 8,9,10. Au cours du développement de la glande mammaire, les macrophages canalaires sont intimement associés à l’arbre canalaire, et leur épuisement entraîne une réduction significative de la ramification11. De plus, les macrophages sont nécessaires à la morphogenèse pendant la puberté et à l’alvéologenèse pendant la grossesse, où ils surveillent activement l’épithélium. Dans les lésions musculaires, une population spécifique de macrophages « habite » dans le site de la lésion, fournissant une niche transitoire dans laquelle ils fournissent les signaux induits par la prolifération nécessaires à la prolifération des cellules souches. Ainsi, ils montrent le rôle spécialisé de populations distinctes de macrophages dans la régulation du processus de réparation2. Dans le poumon, un phénomène similaire se produit lorsque les macrophages interstitiels amorcent les cellules alvéolaires de type II (AT2) exprimant l’interleukine (IL)-R1 pour la conversion en progéniteurs transitoires associés aux dommages par la libération d’IL-1B12. De plus, des recherches récentes ont montré que les macrophages sont essentiels à la régénération de la glande salivaire sous-maxillaire (SMG) de souris après une lésion d’irradiation, et en leur absence, la régénération épithéliale est perturbée13. Prises ensemble, ces données mettent en évidence l’importance de l’activation et de la fonction des macrophages dans les niches inflammatoires transitoires après une lésion tissulaire, ainsi que pendant l’homéostasie.

Les macrophages sont des cellules actives, et leurs fonctions impliquent des interactions avec une variété de types cellulaires différents, y compris le contact direct cellule-cellule14,15, ainsi que des méthodes plus indirectes telles que la sécrétion de facteurs solubles 2,16, qui sont essentiels pour la régulation de niche. Bien que l’imagerie immunofluorescente classique soit utile pour commencer à démêler ces interactions, elle est limitée par la représentation d’un seul instantané dans le temps, omettant ainsi de nombreux points temporels critiques pour un processus régénératif hautement dynamique17,18. Alors que l’importance du timing et l’émergence de différentes vagues de régénération deviennent de plus en plus évidentes, il est essentiel de disséquer ces processus plus en détail.

La radiothérapie est un traitement qui sauve la vie de nombreuses personnes atteintes d’un cancer. Bien qu’elle soit souvent efficace pour réduire ou éliminer la ou les tumeurs, la radiothérapie peut également endommager les tissus sains situés dans le champ de rayonnement et provoquer une réponse immunitaire. Les lésions radiologiques peuvent induire un recrutement rapide de macrophages et des réponses immunomodulatrices directes et indirectes19,20. Les glandes salivaires sont souvent irradiées par inadvertance pendant le traitement du cancer de la tête et du cou21,22, entraînant des lésions épithéliales, une atrophie cellulaire et une fibrose23,24, entraînant une xérostomie ou une sécheresse chronique de la bouche25.

La glande salivaire est composée d’une pléthore de types et de structures cellulaires, y compris, mais sans s’y limiter, les cellules épithéliales (à la fois les cellules acineuses productrices de salive et les cellules canalaires transportant la salive), les cellules myoépithéliales, les cellules progénitrices épithéliales, les nerfs, les vaisseaux sanguins, les cellules immunitaires, les fibroblastes et la matrice extracellulaire (MEC). Le rôle et la réponse de plusieurs de ces types cellulaires dans la réponse régénérative ont déjà été décrits 26,27,28,29,30. Cependant, la façon dont ces différentes cellules interagissent au cours de l’homéostasie et de la régénération, et en particulier le comportement des cellules immunitaires telles que les macrophages, est moins bien étudiée. Ce manuscrit décrit une méthode nouvellement établie pour étudier les interactions vivantes entre les macrophages SMG et d’autres cellules d’intérêt dans les tissus ex vivo. Le pistolet-mitrailleur est découpé sur un vibratome, coloré pour les marqueurs de surface et imagé jusqu’à 12 h. Cette méthode permet d’observer la phagocytose des cellules environnantes par les macrophages, d’étudier la cinétique de migration des macrophages et de mettre en évidence les interactions directes cellule-cellule entre les macrophages et les cellules épithéliales.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni et exécutées dans le cadre des PPL PB5FC9BD2 et PP0330540. Toutes les expériences sont conformes aux directives d’ARRIVE et à celles de l’Université d’Édimbourg.

Des souris de type sauvage ont été obtenues dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Krt14CreER ; Des souris R26mTmG ont été élevées en interne, en croisant des souris Krt14CreER/+ 31 avec des souris R26mTmG/mTmG 32. Dans toutes les expériences, des souris femelles âgées de 8 à 10 semaines ont été utilisées.

1. Collecte et intégration du pistolet-mitrailleur

  1. Euthanasiez la souris ou les souris en les exposant à une concentration croissante de dioxyde de carbone (CO2). Ensuite, vaporisez la zone d’incision avec de l’éthanol à 70 % (EtOH) et utilisez des ciseaux et des pinces pour disséquer soigneusement le ou les SMG des tissus environnants (Figure 1A). Retirez la graisse et le tissu conjonctif à l’aide d’une pince et placez la glande dans un tube de collecte contenant de la solution saline équilibrée Hanks (HBSS) glacée, voir le tableau des matériaux.
  2. Séparez le presse-étoupe en morceaux d’environ 1 cm2 chacun à l’aide d’une pince.
  3. Faites chauffer l’agarose à 4 % à 50 °C, puis versez-la directement dans un plat de 35 mm.
  4. Versez une petite quantité d’agarose fondue à 50 °C dans un plat séparé et rincez abondamment la glande en la déplaçant dans l’excès d’agarose.
    REMARQUE : Cette étape est nécessaire pour éliminer l’excès de liquide des glandes. Un excès de liquides peut empêcher les glandes d’adhérer correctement à l’agarose.
  5. Placez 4 à 6 morceaux de la glande dans l’agarose, en vous assurant qu’ils reposent à plat et qu’ils sont dans le même plan (Figure 1A).
    REMARQUE : Assurez-vous que les glandes ne touchent pas la surface de la gélose ou le fond de la plaque.
  6. Placez le couvercle sur le plat de 35 mm et transférez-le dans une glacière en recouvrant l’assiette de glaçons.
  7. Attendez 5 à 10 minutes pour que l’agarose se solidifie.

2. Sectionnement

  1. À l’aide d’un scalpel, coupez soigneusement autour du bloc d’agarose incrusté dans la glande, en retirant le bloc contenant le tissu de la boîte. Laissez une bordure d’environ 5 mm.
  2. Fixez le bloc d’agarose à la platine du vibratome (voir tableau des matériaux) en appliquant une goutte de superglue, en veillant à ce que toute la surface inférieure du bloc soit en contact avec la superglue.
  3. Laissez la superglue durcir pendant environ 5 minutes. Ensuite, remplissez la chambre du vibratome avec une solution saline (PBS) 1x tamponnée au phosphate (PBS) glacée contenant 1% de pénicilline-streptomycine (P/S).
  4. Ajoutez de la glace sur le côté et au fond de la chambre du vibratome.
    REMARQUE : Maintenez un environnement très froid et remplacez la glace au besoin.
  5. Coupez l’excédent d’agarose et créez des espaces de 5 mm entre chaque morceau de glande en faisant des incisions avec un scalpel. Cela donnera des tranches individuelles.
  6. Alignez la lame du vibratome avec la face du bloc d’agarose et définissez les points de départ et d’arrivée des sections pour obtenir l’épaisseur de tranche souhaitée.
  7. Avant de commencer le processus de coupe, assurez-vous que la lame n’est pas en contact avec le bloc. Cette précaution évitera de couper accidentellement de gros morceaux d’agarose et de perdre des parties de l’échantillon.
  8. Couper des sections d’une épaisseur de 150 μm à une faible vitesse et à des vibrations élevées (par exemple, une vitesse de 3 et un réglage de vibration de 8 à 10 sur une échelle de 1 à 10 pour chaque paramètre) (Figure 1A).
  9. Une fois qu’une section est coupée et libérée dans le PBS environnant, collectez les sections à l’aide d’un pinceau et placez-les dans un plat contenant des milieux préchauffés du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) avec P/S.

3. Culture et coloration des tranches de SMG

  1. Culture
    1. Ajouter 1,5 mL de média RPMI dans chaque puits d’une plaque à 6 puits contenant un filtre de 0,4 μm. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air piégées sous le filtre.
    2. Transférez 1 à 6 tranches sur chaque filtre à l’aide d’un pinceau, en prenant soin de ne pas casser les tranches.
      REMARQUE : Assurez-vous que les tranches ne sont pas immergées dans le média, mais qu’elles flottent sur le filtre. S’ils sont complètement submergés, ils peuvent suffoquer pendant la culture.
    3. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 et changer le milieu tous les 3 jours (figure 1A).
    4. Irradier les plaques expérimentales avec une dose unique de rayonnement gamma de 10 Gy à l’aide d’un irradiateur disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Ensuite, remettez-les dans l’incubateur.
  2. Coloration pour l’imagerie en direct
    1. À l’aide d’un pinceau, soulevez délicatement les tranches du filtre et placez-les dans une plaque de 24 puits contenant 500 μL de milieu de culture par puits, où les tranches seront immergées.
    2. Ajouter les anticorps conjugués et la coloration nucléaire pertinents (voir le tableau des matériaux) dans le milieu aux concentrations appropriées27.
    3. Incuber les tranches avec des anticorps pendant 2 h à 37 °C en agitant doucement.
    4. Lavez les tranches en les immergeant dans des milieux de culture et en les lavant pendant 3 cycles de 10 min à 37 °C en agitant doucement.

4. Montage et imagerie en direct

  1. À l’aide d’une pince, retirez le ruban adhésif d’un côté d’une entretoise d’imagerie double face et collez-le, côté adhésif vers le bas, au fond d’une plaque à 6 puits à fond de verre.
  2. Pipeter 50 μL de milieu dans l’espace au centre de l’entretoise.
  3. Placez la tranche dans le support à l’aide d’un pinceau, en veillant à ce qu’elle repose à plat sans bulles d’air emprisonnées.
  4. À l’aide d’une pipette, retirez délicatement 20 μL de milieu de l’espace.
  5. Retirez le ruban adhésif de la face supérieure de l’entretoise à l’aide d’une pince et placez une lamelle circulaire de 25 mm sur le dessus. Appuyez sur le bord de l’entretoise pour vous assurer que la lamelle est bien fixée, en prenant soin de ne pas casser la lamelle en appliquant trop de force (Figure 1A).
  6. Imagez la tranche à l’aide d’un microscope confocal pendant la période ou les intervalles souhaités (p. ex., toutes les 15 minutes pendant 12 h à l’aide d’un objectif à eau 20x).

Résultats Représentatifs

La réponse des macrophages aux lésions de la glande salivaire sous-maxillaire reste inconnue. Il s’agit notamment de savoir s’ils se localisent et migrent vers des structures spécifiques à l’intérieur de la glande, ainsi que la distance et la vitesse auxquelles ils migrent. Cela a été difficile à déterminer par des approches d’imagerie statique.

Pour y remédier, une approche d’imagerie en direct a été développée pour étudier l’interaction entre les macrophages et les cellules épithéliales en temps réel. La coloration immunofluorescente des tranches a été combinée à un modèle murin de traçage de lignée marqué de manière endogène (Figure 1A et Figure 2A). Dans ce modèle, les tranches ont été exposées à 10 Gy d’irradiation gamma pour induire des lésions d’irradiation et ont été imagées à 2 h, 3 jours et 4 jours après l’irradiation (IR), avec des tranches non irradiées servant de témoins. Les données ont été acquises à partir de quatre canaux : Hoechst (à l’aide du laser 425 pour minimiser la phototoxicité), GFP (488), dTomato (561) et Alexa 647 (640). Une pile z a été effectuée et une image a été capturée tous les 2 à 3 μm, avec un total de 30 à 40 plans collectés, ce qui donne une hauteur totale de 80 à 90 μm.

En utilisant cette technique et en analysant le signal de la tomate (mT) liée à la membrane et l’activité de la caspase3/7, il est devenu évident que les tranches organotypiques conservaient leur structure épithéliale, survivaient en culture et présentaient une mort cellulaire minimale. Les données ont montré que des tranches non irradiées de la glande sous-maxillaire de souris R26mTmG 32, cultivées pendant 7 jours, ont conservé leur signal mT et leur architecture épithéliale (Figure 1B). Cependant, 3 jours après l’irradiation ex vivo, l’atrophie des cellules acineuses et canalaires était évidente (Figure 1B ; structures aciné et canalaire mises en évidence par des lignes blanches et vertes en pointillés, respectivement), ce qui correspond à une lésion radiologique in vivo 13. L’apoptose était négligeable dans les tranches non irradiées, mais il y avait des signes de cellules de caspase 3/7+ dans les coupes irradiées 4 jours après l’irradiation (Figure 1C ; flèches vertes), similaire à la lésion in vivo 33,34. De plus, les tranches irradiées ont récapitulé les dommages à l’ADN in vivo 34,35,36,37, comme indiqué par un taux élevé de γH2AX 38 par rapport aux témoins non irradiés (Figure 1D,E). Ainsi, les coupes organotypiques des glandes salivaires ont montré une bonne viabilité en culture et ont réagi de la même manière que les tissus in vivo à l’irradiation.

Par la suite, les interactions cellule-cellule en temps réel ont été étudiées. Des macrophages interagissant directement avec des cellules progénitrices épithéliales marquées à la GFP (Krt14CreER-GFP) ont été observés sur une période de 12 heures à 3 jours après l’IR (Figure 2A et Vidéo 1). Remarquablement, il était évident que les macrophages restaient à proximité des cellules progénitrices épithéliales pendant des heures, restant souvent en contact pendant toute la période d’imagerie de 12 heures. De plus, une phagocytose en temps réel des cellules épithéliales par les macrophages a été observée, confirmant que les macrophages remplissent leur fonction traditionnelle dans le modèle de culture en tranches (Figure 2B, Vidéos 2 et Vidéo 3). Cette technique a également permis d’identifier que les macrophages sont relativement stationnaires pendant l’homéostasie et après une lésion d’irradiation, probablement en raison de leur forte densité dans les tissus. Cela démontre, pour la première fois, que les macrophages des glandes salivaires ne migrent pas de manière importante pendant l’homéostasie ou après une lésion d’irradiation. Cependant, alors que les macrophages n’ont pas montré de migration significative, les tissus environnants ont montré une dynamique accrue après l’irradiation, avec plusieurs macrophages interagissant activement autour des grappes de cellules épithéliales marquées. De plus, basée uniquement sur la coloration nucléaire, cette technique nous a permis de visualiser le mouvement des cellules à l’intérieur de la tranche au fil du temps, souvent avec des canaux entiers semblant « migrer » dans le tissu (vidéo 4). Au fil du temps, au cours du processus de culture, il est devenu évident que les tranches sont passées d’une morphologie plate à une morphologie de type sphéroïde, ce qui suggère que le mouvement des cellules à l’intérieur de la tranche est probablement dû à leur réarrangement en une structure en forme de sphère, ressemblant à un événement de réorganisation potentiel.

Enfin, les données d’imagerie en direct générées par ce test peuvent être utilisées pour mesurer quantitativement le comportement des cellules, comme la migration. Les cellules individuelles peuvent être détectées et segmentées (figure 3A), et la migration peut être mesurée à l’aide d’un logiciel d’imagerie et d’analyse disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux et la vidéo 5). De plus, l’analyse de l’objet le plus proche peut être entreprise pour déterminer si les cellules, dans ce cas, les macrophages, migrent plus près d’autres cellules d’intérêt, dans ce cas, les cellules Krt14 CreER-GFP+, et comment cette dynamique change au fil du temps (Figure 3B).

figure-representative results-6319
Figure 1 : Récapitulation de la réponse in vivo dans des coupes de tissu des glandes salivaires découpées avec précision. (A) Schéma du protocole expérimental. (B) Images représentatives de la tomate membranaire obtenues à partir de tissus frais de la glande sous-maxillaire (SMG), de tranches de SMG non manipulées cultivées pendant 7 jours, ou de tranches de SMG irradiées avec une dose unique d’irradiation gamma de 10 Gy 3 ou 7 jours plus tôt. Les lignes blanches en pointillés indiquent des exemples de structures acineuses, et les lignes vertes en pointillés indiquent des exemples de structures canalaires. Barre d’échelle = 50 μm. (C) Images représentatives de l’expression de la caspase-3/7 obtenues à partir de tranches de SMG non manipulées ou de tranches de SMG irradiées avec une dose unique d’irradiation gamma de 10 Gy 2 h ou 4 jours plus tôt. Les pointes de flèche vertes indiquent des noyaux positifs. Barre d’échelle = 50 μm. (D) Images représentatives de l’expression de γH2AX obtenues à partir de tranches de SMG non manipulées ou de tranches de SMG irradiées avec une dose unique d’irradiation gamma de 10 Gy 3 jours plus tôt. Barre d’échelle = 20 μm. (E) Expression représentative de γH2AX dans les cellules épithéliales EpCAM+ à partir de coupes de SMG non manipulées ou de coupes de SMG irradiées avec une dose unique d’irradiation gamma de 10 Gy 2 h et 3 jours plus tôt. SSA = zone de dispersion latérale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-representative results-8244
Figure 2 : Imagerie en direct des interactions macrophages-cellules épithéliales et de la phagocytose. (A) Images fixes séquentielles des interactions entre les cellules progénitrices KRT14+ et leur descendance (cellules Krt14 CreER-GFP+) et les macrophages après irradiation. L’imagerie des cellules vivantes capture la dynamique cellulaire sur une période de 90 minutes. Barre d’échelle = 20 μm. La vidéo associée est la vidéo 1. (B) Images fixes séquentielles d’un macrophage phagocytant une cellule épithéliale. L’imagerie des cellules vivantes montre le processus sur une période de 60 minutes. Les flèches blanches pointent vers le macrophage, et les flèches jaunes indiquent le noyau de la cellule subissant la phagocytose. Barre d’échelle = 50 μm. La vidéo associée est la vidéo 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-representative results-9476
Figure 3 : Imagerie en direct pour l’analyse de la dynamique cellulaire. (A) Image illustrant l’identification et la segmentation des cellules individuelles pour l’analyse des paramètres de comportement cellulaire, tels que la migration (voir la vidéo 5). Les cellules sont pseudocolorées de manière aléatoire pour la distinction entre les cellules individuelles et les pistes. Barre d’échelle = 100 μm. (B) Quantification de la distance (en μm) de l’objet le plus proche par rapport aux cellules individuelles Krt14 CreER-GFP+ tracées sur 10 points temporels (images capturées toutes les 5 min). Les données sont présentées sous la forme de la valeur moyenne par puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : Imagerie en direct révélant les interactions dynamiques entre les cellules progénitrices/descendances KRT14+ et les macrophages après irradiation. Les tranches ont été exposées à une dose unique d’irradiation gamma de 10 Gy avant l’imagerie en direct. Les cellulesKrt14 CreER-GFP+ sont représentées en vert, les macrophages (F4/80+) en rouge et les noyaux en cyan. La vidéo se compose d’une seule pile z, couvrant une période de culture de 12 heures avec des images capturées toutes les 15 minutes. Veuillez cliquer ici pour télécharger la vidéo.

Vidéo 2 : Imagerie en direct capturant un macrophage engloutissant une cellule épithéliale. Les macrophages (F4/80+) sont représentés en rouge et les noyaux en cyan. La vidéo se compose d’une seule pile z et s’étend sur une période de culture de 12 h avec des images prises toutes les 15 min. Veuillez cliquer ici pour télécharger la vidéo.

Vidéo 3 : Projection maximale d’images en direct montrant un macrophage engloutissant une cellule épithéliale. Les macrophages (F4/80+) sont affichés en rouge et les noyaux sont affichés en cyan. La vidéo présente une projection maximale d’images z-stack totalisant 80 μm (un seul plan est présenté dans la vidéo 2) et couvre une période de culture de 12 h avec des images prises toutes les 15 min.

Vidéo 4 : Imagerie en direct illustrant le comportement dynamique de l’épithélium des glandes salivaires en culture après irradiation. Les tranches ont été soumises à une dose unique d’irradiation gamma de 10 Gy avant l’imagerie en direct. Les macrophages (F4/80+) sont représentés en rouge, les noyaux en cyan. La vidéo se compose d’une seule pile z, couvrant une période de culture de 12 h avec des images capturées toutes les 15 min. Veuillez cliquer ici pour télécharger la vidéo.

Vidéo 5 : Suivi quantitatif de la migration cellulaire au fil du temps. Cette vidéo montre le traçage individuel de traces cellulaires à partir de vidéos d’imagerie en direct. Les flèches indiquent les traces des cellules, et les cellules sont pseudo-colorées individuellement. La vidéo se compose d’une seule pile en Z et s’étend sur une période de culture de 1 h avec des images prises toutes les 15 min. Veuillez cliquer ici pour télécharger la vidéo.

Discussion

La possibilité de cultiver ex vivo des tissus des glandes salivaires offre une excellente occasion d’étudier les interactions cellule-cellule dans le contexte de l’homéostasie et de la réponse aux blessures. Bien que l’imagerie intravitale de la glande sous-maxillaire de souris soit réalisable39,40, cette technique repose sur l’utilisation de modèles murins rapporteurs fluorescents pour marquer de manière endogène les cellules d’intérêt et doit être réalisée sous anesthésie terminale. Ici, une méthode de culture ex vivo de coupes de glandes sous-maxillaires est décrite, en maintenant l’architecture cellulaire et les interactions cellule-cellule. Cette approche affine les techniques actuelles d’imagerie en direct et offre une alternative à l’imagerie intravitale.

Le maintien à long terme des tissus à l’aide de cette technique repose sur la culture de tranches à l’interface air-liquide. Les modèles d’explants précédents26,41 ont probablement réussi à être cultivés pendant quelques jours seulement parce qu’ils ont été immergés dans des milieux et essentiellement « étouffés ». En revanche, l’utilisation d’un système de culture à interface air-liquide maintient la santé et la structure des tissus pendant une période prolongée, garantissant ainsi une imagerie de haute qualité. La méthode de montage des tranches SMG avant l’imagerie, avec une petite quantité de support et dans une chambre à espace restreint pour maintenir la tranche à plat, fait partie intégrante du succès de la technique. La visualisation des cellules dans ce test dépend de souris rapporteurs marquées de manière endogène ou d’anticorps conjugués par fluorescence. L’abondance de modèles de souris rapporteurs fluorescents transgéniques et d’anticorps conjugués ciblant des types et des sous-ensembles cellulaires spécifiques rend cette méthode adaptée à l’exploration de diverses interactions spécifiques aux cellules.

Bien que cette méthode fournisse un bon modèle de lésions tissulaires in situ et que les lésions d’irradiation ex vivo entraînent une atrophie de la structure acineuse et canalaire, semblable à ce qui se produit in vivo13, certains éléments ne peuvent pas être récapitulés ex vivo. Il s’agit notamment de l’absence de système vasculaire fonctionnel et d’entrée neuronale, ainsi que de l’absence de cellules inflammatoires infiltrantes. Compte tenu du rôle bien documenté des vaisseaux sanguins et des nerfs dans l’homéostasie et la régénération des glandes salivaires26,42 et de l’importance des cellules immunitaires migratrices43, telles que les cellules T et B, dans la fonction des glandes salivaires, la réponse aux blessures, l’infection et la pathogenèse du syndrome de Gougerot-Sjögren (SS) (voirdans 44), ce test peut manquer certaines interactions cellulaires importantes. De plus, les événements migratoires très rapides, tels que le mouvement de la cellule Natural Killer (NK)45 et de la cellule dendritique (DC)46, peuvent être manqués par l’imagerie toutes les 15 minutes. Cependant, les intervalles d’imagerie peuvent être optimisés pour étudier les interactions spécifiques cellule-cellule d’intérêt, et la possibilité d’imager en 3 dimensions grâce à des piles z permet d’évaluer le mouvement des cellules en 3D. Le montage sécurisé du tissu pendant l’imagerie est crucial pour la quantification, comme les mesures de suivi cellulaire. De plus, bien que cette étude ait utilisé des tissus de souris, le protocole fournit une méthode viable pour étudier les interactions cellule-cellule dans les glandes salivaires humaines, générant des informations traductionnelles précieuses inaccessibles par d’autres méthodes.

Alors que le rôle des macrophages résidents dans les tissus dans l’homéostasie et la régénération a été démontré dans plusieurs tissus 2,10,11,12, leur rôle dans les glandes salivaires reste largement sans réponse. Bien que l’on sache que les macrophages sont essentiels à la régénération épithéliale après une lésion d’irradiation13, les mécanismes précis sous-jacents à cet effet restent inconnus. L’imagerie en direct des coupes de glandes salivaires permet de visualiser et d’analyser en temps réel la dynamique complexe des tissus, qui est souvent manquée par l’imagerie confocale traditionnelle. De plus, il est évident que les macrophages subissent des changements dynamiques de forme tout en remplissant diverses fonctions in vivo 47,48,49, et ce protocole fournit probablement une meilleure représentation de ces changements qu’une vue statique typique dans les tissus fixes. De futures études peuvent utiliser cette technique pour étudier comment la communication entre cellules change au cours de l’homéostasie, des blessures et de la régénération/résolution. Cette approche sera utile pour élucider les principales voies de signalisation et les événements qui pourraient finalement offrir des avantages thérapeutiques.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

SE est financé par la subvention 108906/Z/15/Z du Wellcome Trust ; EE est financé par la subvention MR/MRC MR/S005544/1 de l’UKRI et par une bourse du chancelier de l’Université d’Édimbourg. La figure 1A est créée avec BioRender.com.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4 µm filter cell culture inserts (Nunc)Avantor/VWR734-2240Inserts pre-packed in 6-well multidishes, 20 mm × 25 mm
24 well plateCorning3524
35 mm dishFalcon353001
6 well plateCorning3516
CoverslipsPaul Marienfeld GmbH & Co. KG111650Deckglaser Cover Glasses 25 mm diameter 
Double-sided stickerGrace Bio-Labs654004SecureSeal Imaging Spacers SS1 x 13, 13 mm diameter x 0.12 mm depth, 25 mm x 25mm OD
EtOHScientific Laboratories SuppliesCHE1924Absolute ethanol (EtOH) AR, 99.7%
F4/80 antibodyInvitrogen17-4801-82F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), APC, eBioscience
ForcepsFine Science Tools91113-10Student Fine Forceps Straight Broad Shanks
Glass bottom 6 well plateCellvisP06-1.5H-N6 well glass bottom plate with high performance #1.5 cover glass
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14025050+calcium +magnesium, no phenol red
HoechstSigma Aldrich14533Alternative name: bisBenzimide H 33342 trihydrochloride
Ice boxFisher Scientific11339623Azlon Polyurethane Ice Buckets with Lid
Imaging and analysis softwareHarmony
Low Melting AgaroseMerck A9414-25G
PaintbrushWatercolour brush, 10 mm x 2mm tip
Penicillin-StreptomycinSigma AldrichP433310,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered
Phosphate Buffered Saline (PBS)Life Technologies20012027
RPMIThermoFisher12634010Gibco Advanced DMEM/F-12
ScalpelSwann-MortonDisposable scalpels, No. 11 blade
Scissors Fine Science Tools14088-10Extra Narrow Scissors 10.5 cm
Shepherd Mark-I-68A 137Cs irradiatorJL Shepherd & Associates
SuperglueBostikMulti-purpose superglue, fast setting, ultra strong
VibratomeLeicaLeica VT 1000 S
Vibratome bladesAstraSuperior Platinum Double Edge blade
Wild-type (C57BL/BJ) miceCharles River

Références

  1. Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in tissue repair, regeneration, and fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
  2. Ratnayake, D., et al. Macrophages provide a transient muscle stem cell niche via NAMPT secretion. Nature. 591 (7849), 281-287 (2021).
  3. Lucas, T., et al. Differential roles of macrophages in diverse phases of skin repair. J Immunol. 184 (7), 3964-3977 (2010).
  4. Duffield, J. S., et al. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J Clin Invest. 115 (1), 56-65 (2005).
  5. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  6. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
  7. Mass, E., Nimmerjahn, F., Kierdorf, K., Schlitzer, A. Tissue-specific macrophages: how they develop and choreograph tissue biology. Nat Rev Immunol. 23 (9), 563-579 (2023).
  8. Dick, S. A., et al. Three tissue resident macrophage subsets coexist across organs with conserved origins and life cycles. Sci Immunol. 7 (67), (2022).
  9. Hassel, C., Gausserès, B., Guzylack-Piriou, L., Foucras, G. Ductal macrophages predominate in the immune landscape of the lactating mammary gland. Front Immunol. 12, 754661 (2021).
  10. Kolter, J., et al. A subset of skin macrophages contributes to the surveillance and regeneration of local nerves. Immunity. 50 (6), 1482-1497 (2019).
  11. Dawson, C. A., et al. Tissue-resident ductal macrophages survey the mammary epithelium and facilitate tissue remodelling. Nat Cell Biol. 22 (5), 546-558 (2020).
  12. Choi, J., et al. Inflammatory signals induce AT2 cell-derived damage-associated transient progenitors that mediate alveolar regeneration. Cell Stem Cell. 27 (3), 366-382 (2020).
  13. McKendrick, J. G., et al. CSF1R-dependent macrophages in the salivary gland are essential for epithelial regeneration after radiation-induced injury. Sci Immunol. 8 (89), eadd4374 (2023).
  14. Muntjewerff, E. M., Meesters, L. D., vanden Bogaart, G. Antigen cross-presentation by macrophages. Front Immunol. 11, 1276 (2020).
  15. Bissonnette, E. Y., Lauzon-Joset, J. F., Debley, J. S., Ziegler, S. F. Cross-talk between alveolar macrophages and lung epithelial cells is essential to maintain lung homeostasis. Front Immunol. 11, 583042 (2020).
  16. Xue, Q., et al. Analysis of single-cell cytokine secretion reveals a role for paracrine signaling in coordinating macrophage responses to TLR4 stimulation. Sci Signal. 8 (381), (2015).
  17. McArdle, S., Mikulski, Z., Ley, K. Live cell imaging to understand monocyte, macrophage, and dendritic cell function in atherosclerosis. J Exp Med. 213 (7), 1117-1131 (2016).
  18. Gurevich, D. B., et al. Live imaging of wound angiogenesis reveals macrophage orchestrated vessel sprouting and regression. Embo j. 37 (13), (2018).
  19. Meziani, L., et al. CSF1R inhibition prevents radiation pulmonary fibrosis by depletion of interstitial macrophages. Eur Respir J. 51 (3), (2018).
  20. Bickelhaupt, S., et al. Effects of CTGF blockade on attenuation and reversal of radiation-induced pulmonary fibrosis. J Natl Cancer Inst. 109 (8), (2017).
  21. Formenti, S. C., Demaria, S. Systemic effects of local radiotherapy. Lancet Oncol. 10 (7), 718-726 (2009).
  22. Chambers, M. S., Garden, A. S., Kies, M. S., Martin, J. W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: pathogenesis, impact on quality of life, and management. Head Neck. 26 (9), 796-807 (2004).
  23. Radfar, L., Sirois, D. A. Structural and functional injury in minipig salivary glands following fractionated exposure to 70 Gy of ionizing radiation: an animal model for human radiation-induced salivary gland injury. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 96 (3), 267-274 (2003).
  24. Grehn, A. L., Gustafsson, H., Franzén, L., Thornell, L. E., Henriksson, R. Ultrastructural morphometry of parotid acinar cells following fractionated irradiation. Oral Oncol. 33 (1), 23-28 (1997).
  25. Rocchi, C., Emmerson, E. Mouth-watering results: clinical need, current approaches, and future directions for salivary gland regeneration. Trends Mol Med. 26 (7), 649-669 (2020).
  26. Emmerson, E., et al. Salivary glands regenerate after radiation injury through SOX2-mediated secretory cell replacement. EMBO Mol Med. 10 (3), 8051 (2018).
  27. May, A. J., et al. Diverse progenitor cells preserve salivary gland ductal architecture after radiation-induced damage. Development. 145 (21), (2018).
  28. Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nat Commun. 4, 1494 (2013).
  29. Mizrachi, A., et al. Radiation-induced microvascular injury as a mechanism of salivary gland hypofunction and potential target for radioprotectors. Radiat Res. 186 (2), 189-195 (2016).
  30. Friedrich, R. E., Bartel-Friedrich, S., Holzhausen, H. J., Lautenschläger, C. The effect of external fractionated irradiation on the distribution pattern of extracellular matrix proteins in submandibular salivary glands of the rat. J Craniomaxillofac Surg. 30 (4), 246-254 (2002).
  31. Vasioukhin, V., Degenstein, L., Wise, B., Fuchs, E. The magical touch: genome targeting in epidermal stem cells induced by tamoxifen application to mouse skin. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (15), 8551-8556 (1999).
  32. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  33. Gilman, K. E., et al. P2X7 receptor deletion suppresses γ-radiation-induced hyposalivation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 316 (5), R687-R696 (2019).
  34. Ren, J., et al. Radioprotective effects and mechanism of HL-003 on radiation-induced salivary gland damage in mice. Sci Rep. 12 (1), 8419 (2022).
  35. Marmary, Y., et al. Radiation-induced loss of salivary gland function is driven by cellular senescence and prevented by IL6 modulation. Cancer Res. 76 (5), 1170-1180 (2016).
  36. Chang, S., et al. Inorganic nitrate alleviates total body irradiation-induced systemic damage by decreasing reactive oxygen species levels. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 103 (4), 945-957 (2019).
  37. Varghese, J. J., et al. Localized delivery of amifostine enhances salivary gland radioprotection. J Dent Res. 97 (11), 1252-1259 (2018).
  38. Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. gammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair. Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).
  39. Takano, T., et al. Highly localized intracellular Ca(2+) signals promote optimal salivary gland fluid secretion. Elife. 10, (2021).
  40. Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of murine submandibular salivary gland for upright intravital microscopy. J Vis Exp. 135, (2018).
  41. O'Dell, N. L., Sharawy, M. H., Schuster, G. S. Effects of in vivo single and multiple isoproterenol injections on subsequently explanted submandibular glands. Acta Anat (Basel. 105 (4), 431-438 (1979).
  42. Lombaert, I. M., et al. Cytokine treatment improves parenchymal and vascular damage of salivary glands after irradiation). Clin Cancer Res. 14 (23), 7741-7750 (2008).
  43. Stolp, B., et al. Salivary gland macrophages and tissue-resident CD8(+) T cells cooperate for homeostatic organ surveillance. Sci Immunol. 5 (46), 4371 (2020).
  44. Verstappen, G. M., Pringle, S., Bootsma, H., Kroese, F. G. M. Epithelial-immune cell interplay in primary Sjögren syndrome salivary gland pathogenesis. Nat Rev Rheumatol. 17 (6), 333-348 (2021).
  45. Vanherberghen, B., et al. Microwell-based live cell imaging of NK cell dynamics to assess heterogeneity in motility and cytotoxic response. Methods Mol Biol. 1441, 87-106 (2016).
  46. de Winde, C. M., Munday, C., Acton, S. E. Molecular mechanisms of dendritic cell migration in immunity and cancer. Med Microbiol Immunol. 209 (4), 515-529 (2020).
  47. Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
  48. Paterson, N., Lämmermann, T. Macrophage network dynamics depend on haptokinesis for optimal local surveillance. Elife. 11, (2022).
  49. Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Immunologie et infectionnum ro 201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.