唾液腺における細胞間相互作用の Ex Vivo Live Cell Imaging(英語)

要約

免疫蛍光イメージングは、複雑で時間依存の生物学的プロセスを1つのスナップショットで観察する能力に制約があります。この研究は、精密にカットされたマウスの顎下腺スライスで実施されたライブイメージングアプローチの概要を説明します。このアプローチにより、ホメオスタシス中の細胞間相互作用や再生・修復の過程をリアルタイムで観察することができます。

要約

唾液腺の再生は、さまざまな細胞タイプ間の複雑な相互作用を含む複雑なプロセスです。最近の研究では、マクロファージが再生応答の駆動に果たす極めて重要な役割に光が当てられています。しかし、この重要な役割についての私たちの理解は、主に固定組織生検から得られた静的な見解に依存していました。この制限を克服し、これらの相互作用に関する洞察をリアルタイムで得るために、この研究では、唾液腺組織 をex vivo で培養し、細胞遊走のライブ画像をキャプチャするための包括的なプロトコルの概要を説明します。

プロトコルは複数の主ステップを含む: 最初に、マウスの顎下唾液腺のティッシュはビブラトームを使用して注意深くスライスされ、次に気液体インターフェイスで培養される。これらのスライスは、例えば放射線への曝露によって意図的に損傷し、細胞の損傷を誘発し、再生反応を引き起こす可能性があります。目的の特定の細胞を追跡するために、特定のタンパク質が緑色蛍光タンパク質(GFP)でマークされている遺伝子改変マウスから採取した唾液腺組織を利用するなどして、内因的に標識することができます。あるいは、蛍光標識抗体を使用して、目的の特定の細胞表面マーカーを発現する細胞を染色することもできます。準備が完了すると、唾液腺スライスは、12時間にわたってハイコンテント共焦点イメージングシステムを使用してライブイメージングにかけられ、画像は15分間隔で撮影されます。次に、得られた画像をコンパイルしてムービーを作成し、その後、それを分析して貴重な細胞挙動パラメータを抽出できます。この革新的な方法は、損傷後の唾液腺内のマクロファージ相互作用を調査し、よりよく理解するための強力なツールを研究者に提供し、それによって、このダイナミックな生物学的状況において作用する再生プロセスに関する知識を深めます。

概要

マクロファージは、再生と修復の過程においてますます重要な役割を担うことが示されており、古典的な免疫機能を超えて広がっています^1,2。実際、マクロファージは再生に関連する多くのプロセスに関与しており、修復のすべての段階で重要な調節活性を示し、瘢痕形成や線維化も示しています^3,4。組織常在マクロファージは、多様な細胞表現型を駆動する複雑なメカニズムを持つ非常に不均一な細胞型であり、臓器の発生、機能、および恒常性に不可欠な役割を果たします(⁵でレビュー)。組織に常在するマクロファージは、最初は卵黄嚢と胎児の肝臓の前駆体から発生し、その後、既存のマクロファージの寿命と^{それらが存在する組織}またはニッチに応じて、さまざまな速度で増殖または骨髄由来の血液単球に置き換えられます^6,7。

重要なことは、組織に常在するマクロファージがすべての組織に分散し、多様な臓器機能に寄与していることです。それらは、ニッチ固有の機能を実行するために、微小環境によって独自にプログラムされています。このため、組織内のマクロファージの局在は、肺、乳腺、腸、皮膚、および筋肉で観察されたユニークな集団で、それらの機能に関する洞察を提供します^8,9,10。乳腺の発達中、乳管マクロファージは乳管樹と密接に関連しており、それらの枯渇は枝分かれの有意な減少をもたらす¹¹。さらに、マクロファージは思春期の形態形成や妊娠中の肺胞形成に必要であり、上皮を活発に監視しています。筋肉損傷では、マクロファージの特定の集団が損傷部位内に「住み着き」、幹細胞の増殖に必要な増殖誘導の手がかりを供給する一時的なニッチを提供します。したがって、それらは^{修復プロセスを支配する}上で異なるマクロファージ集団の特殊な役割を示しています2。肺では、間質性マクロファージがインターロイキン(IL)-R1を発現する肺胞II型(AT2)細胞をプライミングし、IL-1Bの放出を介して損傷関連一過性前駆細胞に変換するという同様の現象が起こります¹²。さらに、最近の研究では、被曝傷害後のマウス顎下唾液腺(SMG)の再生にマクロファージが必須であり、マクロファージが存在しないと上皮再生が阻害されることが明らかになっています¹³。まとめると、このデータは、組織損傷後および恒常性維持中の一過性炎症性ニッチにおけるマクロファージの活性化と機能の重要性を強調しています。

マクロファージは活性細胞であり、その機能には、細胞間の直接的な接触^14,15や、ニッチな調節に不可欠な可溶性因子^の分泌^2,16などのより間接的な方法など、さまざまな細胞タイプとの相互作用が含まれます。古典的な免疫蛍光イメージングは、これらの相互作用の解明を開始するのに有用であるが、それは時間内の単一のスナップショットのみを描写することによって制限され、それによって高度に動的な再生プロセスに重要な多数の時点を省略する^17,18。タイミングの重要性と再生のさまざまな波の出現がより鮮明になるにつれて、これらのプロセスをより詳細に分析することが不可欠です。

放射線治療は、がんと診断された多くの人にとって命を救う治療法です。放射線療法は、腫瘍の縮小や除去に効果的であることが多い一方で、放射線野に横たわる健康な組織を損傷し、免疫反応を誘発することもあります。放射線障害は、急速なマクロファージの動員、および直接的および間接的な免疫調節反応を誘発する可能性があります^19,20。頭頸部がんの治療中に唾液腺に不注意で照射されることが多く^21,22、上皮損傷、細胞萎縮、線維症^23,24を引き起こし、口腔乾燥症や慢性口渇²⁵を引き起こします。

唾液腺は、上皮細胞(唾液を産生する腺房細胞と唾液を輸送する乳管細胞の両方)、筋上皮細胞、上皮前駆細胞、神経、血管、免疫細胞、線維芽細胞、細胞外マトリックス(ECM)など、多数の細胞の種類と構造で構成されています。再生応答におけるこれらの細胞型の多くの役割と応答は、以前に説明されています^{26、27、28、29、30}。しかし、これらの異なる細胞がホメオスタシスと再生の間にどのように相互作用するか、特にマクロファージなどの免疫細胞がどのように振る舞うかについては、あまりよく研究されていません。この原稿では、SMGマクロファージと ex vivo 組織内の他の目的細胞との間の生きた相互作用を研究するために新たに確立された方法について説明しています。SMGはビブラトームでスライスされ、表面マーカーのために染色され、最大12時間画像化されます。この方法を用いることで、マクロファージによる周辺細胞の貪食を観察し、マクロファージ遊走速度を研究し、マクロファージと上皮細胞との直接的な細胞間相互作用を示すことができます。

プロトコル

すべての手続きは英国内務省によって承認され、PPL PB5FC9BD2およびPP0330540の下で実施されました。すべての実験は、ARRIVEガイドラインとエジンバラ大学のガイドラインに沿っています。

野生型マウスを市販品として入手した( 資料表参照)。 Krt14^{CreERです。} R26^mTmG マウスは、 Krt14^CreER/+ マウス³¹ とR26^mTmG/mTmG マウス³²を交配して、ハウスで飼育した。すべての実験で、8〜10週齢の雌マウスを使用しました。

1. SMGの収集と埋め込み

1. マウス/マウスを二酸化炭素(CO₂)濃度の上昇にさらして安楽死させます。その後、切開部に70%エタノール(EtOH)をスプレーし、ハサミと鉗子を使用して周囲の組織からSMGを慎重に解剖します(図1A)。鉗子を使用して脂肪組織と結合組織を取り除き、氷冷したハンクス平衡塩溶液(HBSS、 材料表を参照)を含む収集チューブに腺を入れます。
2. 鉗子を使用して、腺をそれぞれ約1 cm² の小片に分離します。
3. 4%アガロースを50°Cに加熱し、35mmのディッシュに直接注ぎます。
4. 少量の溶融した50°Cアガロースを別の皿に注ぎ、余分なアガロースの中で腺を動かして腺を完全にすすいでください。
   注意: この手順は、腺から余分な液体を取り除くために必要です。液体が多すぎると、腺がアガロースに適切に付着しなくなる可能性があります。
5. 腺の4〜6個の断片をアガロースに配置し、それらが平らで同じ平面にあることを確認します(図1A)。
   注意: 腺が寒天の表面またはプレートの底に触れていないことを確認してください。
6. 35mmの皿に蓋をしてアイスボックスに移し、プレートを氷で覆います。
7. アガロースが固まるまで5〜10分待ちます。

2. セクショニング

1. メスを使用して腺に埋め込まれたアガロースブロックの周りを慎重に切断し、組織を含むブロックを皿から取り除きます。.約5mmの境界線を残します。
2. アガロースブロックをビブラトームのステージ( 材料表を参照)に瞬間接着剤を一滴垂らし、ブロックの底面全体が瞬間接着剤に接触するように取り付けます。
3. 瞬間接着剤を約5分間固めます。次に、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)を含む氷冷した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でビブラトームチャンバーを満たします。
4. ビブラトームチャンバーの側面と底の両方に氷を追加します。
   注意: 非常に寒い環境を維持し、必要に応じて氷を交換してください。
5. 余分なアガロースを切り取り、メスで切開して各腺の間に5mmの隙間を作ります。これにより、個々のスライスが生成されます。
6. ビブラトームブレードをアガロースブロックの面に合わせ、切片の始点と終点を設定して、希望のスライスの厚さを実現します。
7. 切断プロセスを開始する前に、ブレードがブロックに接触していないことを確認してください。この予防措置により、アガロースの大きな破片を誤って切断したり、サンプルの一部を紛失したりするのを防ぐことができます。
8. 低速および高振動(たとえば、各パラメータのスケール1〜10で速度3、振動設定8〜10)で厚さ150μmの切断セクション(図1A)。
9. 切片を切断して周囲のPBSに放出したら、絵筆を使用して切片を収集し、P/Sで予め温めたロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地を含む皿に入れます。

3. SMGスライスの培養と染色

1. 培養
   1. 0.4 μm フィルターを含む 6 ウェルプレートの各ウェルに 1.5 mL の RPMI 培地を添加します。フィルターの下に気泡が閉じ込められていないことを確認してください。
   2. スライスを壊さないように注意しながら、絵筆を使用して各フィルターに1〜6スライスを移します。
      メモ: スライスが用紙に浸かっているのではなく、フィルターに浮いていることを確認します。完全に水没すると、培養中に窒息する可能性があります。
   3. 37°Cで5%_CO2でインキュベートし、3日ごとに培地を交換します(図1A)。
   4. 市販の照射器を用いて、10Gyのガンマ線を単回照射する実験プレートを照射する( 材料表参照)。その後、インキュベーターに戻します。
2. ライブイメージングのための染色
   1. 絵筆を使用して、スライスをフィルターからそっと持ち上げ、ウェルあたり500 μLの培地を含む24ウェルプレートに入れ、スライスを水没させます。
   2. 関連する標識抗体および核染色剤( 材料表を参照)を適切な濃度で培地に添加します²⁷。
   3. スライスを抗体とともに37°Cで2時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートします。
   4. スライスを培地に浸し、穏やかに撹拌しながら37°Cで10分間の洗浄を3回行って洗浄します。

4. 取り付けとライブイメージング

1. 鉗子を使用して、両面イメージングスペーサーの片側からテープをはがし、粘着面を下にしてガラス底の6ウェルプレートの底に接着します。
2. 50 μLの培地をスペーサー中央の隙間にピペットで入れます。
3. 絵筆を使ってスライスをメディアに入れ、気泡が閉じ込められていない平らな状態にします。
4. ピペットを使用して、ギャップから20 μLの培地を慎重に取り除きます。
5. 鉗子を使用してスペーサーの上面からテープをはがし、その上に25mmの円形カバーガラスを置きます。スペーサーの端を押してカバーガラスがしっかりと取り付けられるようにし、力を入れすぎてカバーガラスが壊れないように注意してください(図1A)。
6. 共焦点顕微鏡で、必要な期間または間隔でスライスを画像化します(例:20倍の水対物レンズを使用して、15分ごとに12時間)。

ディスカッション

唾液腺組織をex vivoで培養する能力は、ホメオスタシスと損傷応答の両方の文脈で細胞間相互作用を研究する絶好の機会を提供します。マウス顎下腺の生体内イメージングは実現可能であるが^39,40、この技術は、蛍光レポーターマウスモデルを使用して目的の細胞を内因的に標識することに依存しており、終末麻酔下で実施する必要があります。ここでは、細胞構造と細胞間相互作用を維持しながら、ex vivoで顎下腺スライスを培養する方法について説明する。このアプローチは、現在のライブイメージング技術を改良し、生体内イメージングに代わるものを提供します。

この技術を用いた組織の長期維持は、空気と液体の界面でのスライスの培養に依存しています。以前の外植体モデル^26,41は、培地に浸かり、本質的に「窒息」したため、わずか数日間で培養に成功した可能性があります。対照的に、空気-液体界面培養システムの使用は、組織の健康と構造を長期間維持し、高品質のイメージングを保証します。イメージング前にSMGスライスを少量の培地で、スペースが限られたチャンバー内にマウントしてスライスを平らに保つ方法は、この技術の成功に不可欠です。このアッセイにおける細胞の可視化は、内在的に標識されたレポーターマウスまたは蛍光標識抗体に依存します。この分析法は、特定の細胞タイプおよびサブセットを標的とするトランスジェニック蛍光レポーターマウスモデルおよび標識抗体が豊富にあるため、さまざまな細胞特異的相互作用の探索に適しています。

この方法は、in vivoで発生するものと同様に、in situおよびex vivo照射傷害が腺房および管構造の萎縮をもたらす組織の優れたモデルを提供します¹³、一部の要素はex vivoで再現できません。これらには、機能している血管系およびニューロン入力の欠如、ならびに浸潤性炎症細胞の欠如が含まれる。唾液腺の恒常性と再生における血管と神経の役割は十分に文書化されており^26,42、唾液腺機能、損傷反応、感染、シェーグレン症候群(SS)の病因(⁴⁴でレビュー)におけるT細胞やB細胞などの遊走性免疫細胞⁴³の重要性を考えると、このアッセイはいくつかの重要な細胞相互作用を見逃す可能性があります。さらに、ナチュラルキラー(NK)細胞⁴⁵や樹状細胞(DC)⁴⁶の動きなど、非常に速い遊走イベントは、15分ごとのイメージングでは見逃される可能性があります。しかし、イメージング間隔は、関心のある特定の細胞間相互作用を研究するために最適化することができ、zスタックを介して3次元でイメージングする機能により、3D細胞の動きを評価することができます。イメージング中に組織をしっかりと固定することは、細胞追跡測定などの定量化に不可欠です。なお、この調査がマウスティッシュを利用したが、プロトコルは人間の唾液腺の細胞細胞相互作用を調査するための実行可能な方法を提供し、他の方法によって達成できない貴重な翻訳情報を生成する。

ホメオスタシスと再生における組織常在マクロファージの役割は、いくつかの組織で実証されています^{が2,10,11,12}、唾液腺におけるそれらの役割は、ほとんど解明されていません。マクロファージは被曝傷害後の上皮再生に必須であることが知られている^が13、その正確なメカニズムは不明である。唾液腺スライスのライブイメージングにより、従来の共焦点イメージングでは見落とされがちな複雑な組織動態のリアルタイム可視化と解析が可能になります。さらに、マクロファージはin vivoでさまざまな機能を果たしながら形状が動的に変化することは明らかであり^47,48,49、このプロトコルは、固定組織における典型的な静的なビューよりもこれらの変化をよりよく表現する可能性があります。今後の研究では、この手法を利用して、ホメオスタシス、損傷、再生/解決の過程で細胞間コミュニケーションがどのように変化するかを調べることができます。このアプローチは、最終的に治療上の利益をもたらす可能性のある主要なシグナル伝達経路とイベントを解明するのに役立ちます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 µm filter cell culture inserts (Nunc)	Avantor/VWR	734-2240	Inserts pre-packed in 6-well multidishes, 20 mm × 25 mm
24 well plate	Corning	3524
35 mm dish	Falcon	353001
6 well plate	Corning	3516
Coverslips	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	111650	Deckglaser Cover Glasses 25 mm diameter
Double-sided sticker	Grace Bio-Labs	654004	SecureSeal Imaging Spacers SS1 x 13, 13 mm diameter x 0.12 mm depth, 25 mm x 25mm OD
EtOH	Scientific Laboratories Supplies	CHE1924	Absolute ethanol (EtOH) AR, 99.7%
F4/80 antibody	Invitrogen	17-4801-82	F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), APC, eBioscience
Forceps	Fine Science Tools	91113-10	Student Fine Forceps Straight Broad Shanks
Glass bottom 6 well plate	Cellvis	P06-1.5H-N	6 well glass bottom plate with high performance #1.5 cover glass
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Life Technologies	14025050	+calcium +magnesium, no phenol red
Hoechst	Sigma Aldrich	14533	Alternative name: bisBenzimide H 33342 trihydrochloride
Ice box	Fisher Scientific	11339623	Azlon Polyurethane Ice Buckets with Lid
Imaging and analysis software	Harmony
Low Melting Agarose	Merck	A9414-25G
Paintbrush			Watercolour brush, 10 mm x 2mm tip
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Life Technologies	20012027
RPMI	ThermoFisher	12634010	Gibco Advanced DMEM/F-12
Scalpel	Swann-Morton		Disposable scalpels, No. 11 blade
Scissors	Fine Science Tools	14088-10	Extra Narrow Scissors 10.5 cm
Shepherd Mark-I-68A 137Cs irradiator	JL Shepherd & Associates
Superglue	Bostik		Multi-purpose superglue, fast setting, ultra strong
Vibratome	Leica		Leica VT 1000 S
Vibratome blades	Astra		Superior Platinum Double Edge blade
Wild-type (C57BL/BJ) mice	Charles River