نمذجة اضطرابات طيف الكحول الجنيني في أسماك الزرد لتوصيف تأثير البيئة الجنينية المعاكسة على السلوك الاجتماعي للبالغين

Summary

الهدف من البروتوكول الحالي هو تحديد الخطوات اللازمة لإنشاء واستخدام اختبار التفضيل الاجتماعي لأسماك الزرد البالغة وإثبات أنه يمكن استخدامه لتوصيف العيوب الاجتماعية التي يسببها الإيثانول.

Abstract

تصف اضطرابات طيف الكحول الجنيني (FASD) جميع العيوب الخلقية التي يسببها الكحول. ترتبط العيوب الخلقية مثل نقص النمو والتشوهات القحفية والوجهية والسلوكية والمعرفية ب FASD. الصعوبات الاجتماعية هي تشوهات سلوكية شائعة مرتبطة باضطراب الاضطرابات النفسية الوحشية وغالبا ما تؤدي إلى مشاكل صحية خطيرة. تعتبر النماذج الحيوانية ضرورية لفهم الآليات المسؤولة عن العيوب الاجتماعية التي يسببها الإيثانول. أسماك الزرد هي فقاريات اجتماعية تنتج بيضا شفافا مخصبا خارجيا. توفر هذه الخصائص للباحثين إجراء دقيقا ولكنه بسيط لإنشاء النمط الظاهري ل FASD وسلوك فطري يمكن الاستفادة منه لنمذجة العجز الاجتماعي المرتبط ب FASD. وبالتالي ، فإن أسماك الزرد مثالية لتوصيف العجز الاجتماعي ل FASD. الهدف من البروتوكول الحالي هو تزويد المستخدم بفحص سلوكي بسيط يمكن استخدامه لتوصيف عواقب البيئة السلبية في وقت مبكر من التطور والآثار التي يمكن أن تحدثها على السلوك الاجتماعي في مرحلة البلوغ. يمكن استخدام البروتوكول لتوصيف تأثير الطفرات أو المسخين على السلوك الاجتماعي للبالغين. يوضح البروتوكول الموضح هنا كيفية توصيف السلوك الاجتماعي للأسماك الفردية خلال اختبار اجتماعي مدته 20 دقيقة. علاوة على ذلك ، توفر البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام البروتوكول الحالي دليلا على أنه يمكن استخدام البروتوكول لتوصيف آثار العيوب الاجتماعية التي يسببها الإيثانول الجنيني في أسماك الزرد البالغة.

Introduction

يمكن أن يؤدي التعرض للكحول قبل الولادة إلى مجموعة متنوعة من العيوب الخلقية المعروفة مجتمعة باسم اضطرابات طيف الكحول الجنيني (FASD)¹. السلوك الضعيف ، مثل الصعوبات الاجتماعية ، هي عيوب خلقية شائعة مرتبطة ب FASD^2،3. لسوء الحظ ، تؤدي الصعوبات الاجتماعية في كثير من الأحيان إلى مشاكل خطيرة في الصحة^{العقلية 4} ، والتي يمكن أن تؤثر سلبا على نوعية حياة الأفراد المصابين باضطراب الاضطرابات النفسية الشديدة. وبالتالي ، فإن فهم الآليات المسؤولة عن العيوب الاجتماعية التي يسببها الإيثانول أمر بالغ الأهمية.

تتمتع أسماك الزرد بخصائص بيولوجية وسلوكية تجعلها مناسبة تماما لتعزيز فهمنا للآليات المسؤولة عن العيوب الاجتماعية التي يسببها الإيثانول. على سبيل المثال ، تنتج أسماك الزرد كميات كبيرة من البيض الشفاف المخصب خارجيا. تسمح هذه الخصائص البيولوجية للباحثين بإنشاء أنماط ظاهرية FASD دقيقة وقابلة للتكرار^{بسهولة 5}. لتعريض الأجنة للإيثانول بعد 24 ساعة من الإخصاب (hpf) ، يتعين على المرء ببساطة استخدام مجهر تشريح لفحص البويضة الشفافة وتنظيم الجنين بناء على العمل المنشور مسبقا مثل Kimmel et ^al.6 ، ثم وضع البويضة في تركيز الإيثانول المطلوب للمدة المطلوبة. نظرا لأن المشيمة هي حاجز ضعيف للكحول⁷ ، فإن الإيثانول يستحم الجنين بسهولة. لوقف التعرض ، يتعين على المرء ببساطة إزالة البيض من محلول الإيثانول. إلى جانب تزويد الباحثين بطريقة بسيطة ولكنها دقيقة لإنشاء أنماط ظاهرية FASD ، تسمح أسماك الزرد أيضا للباحثين بإجراء مقارنات جينية مع البشر لأن 70٪ من الجينات البشرية لديها تقويم العظام لسمك الزرد ، وبالتالي فهي أداة قيمة لفهم الجينات المرتبطة بالأمراض البشرية⁸. بالإضافة إلى ذلك ، على عكس النماذج الحيوانية الأخرى ، تشكل أسماك الزرد مجموعات اجتماعية⁹ تسمى المياه الضحلة¹⁰. يمكن استخدام سلوك الضحلة لتوصيف تأثيرات التعرض للإيثانول الجنيني على السلوك^{الاجتماعي 11}. علاوة على ذلك ، في سمك الزرد ، يمكن استخلاص استجابة اجتماعية باستخدام المحفزات الاجتماعية التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر¹² أو حافز اجتماعي حي¹³.

ميزت الأعمال السابقة الاستجابة الاجتماعية لأسماك الزرد البالغة في المجموعات¹⁴ ، ولكن أحد قيود هذا النهج هو عدم القدرة على ربط سلوك سمكة فردية بمقياس محدد مثل التغيرات في مستويات الناقل العصبي¹¹. سيمنح البروتوكول التالي المستخدمين القدرة على توصيف السلوك الاجتماعي لأسماك الزرد البالغة. نظرا لأن السلوك الاجتماعي يتم اكتسابه للأسماك الفردية ، يمكن لمستخدمي البروتوكول الآن ربط الملف السلوكي المكتسب لكل سمكة بنتيجة تابعة. على سبيل المثال ، أظهر العمل السابق أن التعرض للإيثانول الجنيني يضعف استجابة الدوبامين للتحفيز الاجتماعي¹¹. في حين أن البيانات الموضحة هنا قد استخدمت التعرض للإيثانول الجنيني كمتغير مستقل ، يمكن لمستخدمي البروتوكول توصيف تأثيرات العلاجات الدوائية الأخرى أو الطفرات الجينية على السلوك الاجتماعي. علاوة على ذلك ، لا يقتصر مستخدمو البروتوكول على فحص كيفية تغيير العلاجات الجنينية للسلوك ولكن يمكنهم أيضا تحديد كيفية تأثير العلاجات الدوائية الحادة في أسماك الزرد البالغة على السلوك الاجتماعي¹⁵.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (IACUC) بجامعة ساوث داكوتا.

1. إسكان أسماك الزرد والرعاية والتعرض للإيثانول الجنيني

1. قم بتربية وتربية أسماك الزرد كما هو موضح¹⁶.
2. التعرض للإيثانول
   1. اختر المرحلة التنموية المناسبة لإجراء التعرض للإيثانول. في هذا البروتوكول ، تعرضت الأجنة للإيثانول عند 24 hpf.
   2. ضع البيض في حجم / حجم الإيثانول بنسبة 1.0٪ لمدة 2 ساعة^{و 15}. نسبة 1 بيضة لكل مل من EM هي ممارسة جيدة. على وجه التحديد ، ضع الأجنة في 50 مل من وسط الجنين (EM ؛ يرجى الاطلاع على Westerfield¹⁶ للحصول على وصفة EM) ثم قم بإزالة 500 ميكرولتر من EM واستبدلها ب 500 ميكرولتر من الإيثانول.
   3. بعد التعرض للإيثانول ، قم برفع الأجنة كما هو موضح¹⁷. فحص السلوك الاجتماعي عندما يبلغ عمر الأسماك 16 أسبوعا.

2. التوزيع العشوائي وإعداد الخزان

1. باستخدام مولد تسلسل عشوائي عبر الإنترنت ، قم بترتيب جميع التجارب بشكل عشوائي مسبقا لإجراء المقايسات السلوكية. تأكد من أن الجانب المنبه ومجموعات العلاج يختلفان بشكل عشوائي.
2. لتجنب أي عوامل مربكة مثل الوقت من اليوم أو يوم الاختبار ، ابدأ الفحص السلوكي وأنهايته في نفس الوقت كل يوم وقم بإجراء الاختبار السلوكي في أيام متتالية حتى يتم اختبار جميع الأسماك التجريبية.
3. لهذا الاختبار (الشكل 1) ، استخدم خزانا سعة 37 لترا (50 سم × 25 سم × 30 سم ، الطول × العرض × الارتفاع) مع خزانات سعة 1.4 لتر موضوعة في الخارج على طول عرض الخزان كما هو موضح^{سابقا 17}.
4. قم بتبطين الجزء الخلفي والسفلي من الخزان سعة 37 لترا بالبلاستيك المموج الأبيض لزيادة التباين بين الأسماك التجريبية والخلفية لتحسين تتبع الفيديو.
5. ضع البلاستيك المموج على الجدار الخارجي للخزانات سعة 1.4 لتر لزيادة تباين الحافز الاجتماعي للأسماك التجريبية. أخيرا ، ضع البلاستيك المموج الأبيض بين الخزانات سعة 1.4 لتر والخزانات سعة 37 لترا ؛ يستخدم هذا الحاجز غير الشفاف لمنع الأسماك التجريبية من مشاهدة الحافز الاجتماعي أثناء التعود.
6. ضع الكاميرا على مسافة بعيدة بما يكفي لالتقاط الطول الكامل للخزان سعة 37 لترا بالإضافة إلى نصف الخزانات سعة 1.4 لتر وتتبع الأسماك التجريبية البالغة بدقة.
   ملاحظة: تضمن معرفة الجانب الذي يحمل الحافز أن الباحثين قد قاموا بتسمية مناطق التتبع بشكل صحيح ويوفر التكرار كنسخة احتياطية.
7. إذا لم يتم استخدام تتبع الأشعة تحت الحمراء ، فتأكد من إضاءة الخزان سعة 37 لترا. استخدم أي مصابيح شفاط حوض السمك متوفرة تجاريا مع مصباح الطيف الكامل T8 بقدرة 15 واط.
   ملاحظة: إذا تم إعداد ساحات متعددة ، فاستخدم أغطية أحواض السمك المتطابقة مع مصابيح متطابقة.

3. إجراء الفحص الاجتماعي

1. ابدأ بملء الخزان سعة 37 لترا المستخدم في الفحص السلوكي بماء مطابق للمياه المستخدمة في رف السكن. تأكد من أن درجة حرارة الماء في حدود 2 درجة مئوية من رف السكن.
2. في نهاية اليوم ، قم بإفراغ الخزان سعة 37 لترا. ابدأ كل يوم اختبار بالماء العذب. تأكد من أن مستوى الماء في الخزان سعة 37 لترا ومستوى الماء في خزانات سعة 1.4 لتر متطابقان. إذا كانت درجة حرارة الغرفة لا تحافظ على الماء في الخزان سعة 37 لترا عند 28.5 درجة مئوية 2 درجة مئوية ، فاستبدل الماء بالماء الدافئ عند 28.5 درجة مئوية.
3. بعد ذلك ، قم بإعداد مناطق الاهتمام. استشر برنامج التتبع اليدوي للمستخدم الذي يختاره لإنشاء مناطق. في هذا البروتوكول ، على طول الخزان سعة 37 لترا في الأعلى والأسفل ، تم استخدام شريط قياس لتمييز زيادات 5 سم. بالنظر إلى أن خزان الاختبار يبلغ 50 سم ، فإن الزيادات البالغة 5 سم تؤدي إلى 10 مناطق يبلغ طول كل منها 5 سم.
4. باستخدام العلامات التي تم إجراؤها على الخزان سعة 37 لترا كمرجع ، استخدم البرنامج لإنشاء المناطق عن طريق توصيل نقطة 5 سم في الأعلى بنقطة 5 سم المقابلة في الأسفل. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإنشاء منطقة على طول الجزء السفلي وعلى طول المنبه. تخصيص مناطق الاهتمام.
5. استخدم برنامج التتبع في هذا البروتوكول لقياس المسافة من المنطقة والمدة التي تقضيها في المنطقة. في هذا البروتوكول تم استخدام 12 منطقة.
6. حدد الوقت الذي تقضيه في المناطق من 1 إلى 10 والمسافة من التحفيز والقاع على أنها المنطقة 1 ، باعتبارها المنطقة الأقرب إلى التحفيز بينما المنطقة 10 هي الأبعد عن التحفيز.
7. بعد ذلك ، حدد الذكور والإناث اللتين سيتم استخدامهما للتحفيز الاجتماعي. أفضل الممارسات هي استخدام الذكور والإناث من نفس المجموعة مثل الأسماك التجريبية. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، فحاول العثور على الأسماك التي تتناسب مع سلالة الأسماك التجريبية وعمرها وحجمها.
8. نقل الأسماك التجريبية من خزان الإسكان إلى ساحة الاختبار (خزان 37 لترا). استخدم شبكة لصيد الأسماك في حوض الإسكان. ضع الشبكة مع السمك فيها في وعاء به ماء السمك.
   ملاحظة: سيؤدي استخدام هذا النهج إلى تقليل الضغط على الأسماك التجريبية أثناء التنقل بين الخزانات.
9. ضع السمكة التجريبية في وسط ساحة الاختبار.
10. بمجرد أن تكون إعدادات الكشف مرضية بناء على البرنامج الذي يختاره المستخدم (راجع دليل المستخدم) ، ابدأ الإصدار التجريبي لمدة 20 دقيقة. خلال أول 10 دقائق ، اترك الحاجز غير الشفاف بين الخزان سعة 37 لترا والخزانات سعة 1.4 لتر في مكانه. سيمنع هذا الأسماك التجريبية من رؤية الحافز الاجتماعي ، الذي يتكون من ذكرين واثنين من أنثى أسماك الزرد ، ويسمح للأسماك بالتأقلم مع ساحة الاختبار^13،17.
11. بعد 10 دقائق ، قم بإزالة الحواجز غير الشفافة بعناية عن طريق سحبها من خلف الخزان ؛ سيسمح ذلك للأسماك التجريبية برؤية الحافز الاجتماعي.
12. استخدم برنامج التتبع لتتبع سلوك الأسماك التجريبية ^{11 و 12 و 17} وتحديده بناء على تفضيلات المستخدم ودليل البرنامج. في البروتوكول الحالي ، حدد المسافة من الحافز الاجتماعي وقاع الخزان بالإضافة إلى الوقت الذي تقضيه في جميع المناطق.
13. تحليل البيانات باستخدام أدوات تحليل البيانات التقليدية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم تعديل الشكل 2 من Fernandes et ^al.17 ويوضح أن التعرض للإيثانول الجنيني يخفف من استجابة المياه الضحلة من خلال فحص المسافة من المنبه. تمثل البيانات الواردة في الشكل 2 المسافة من الحافز الاجتماعي خلال التجربة التي استمرت 20 دقيقة. يظهر ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تتمتع أسماك الزرد بعدد من الخصائص البيولوجية والسلوكية مما يجعلها كائنا جذابا للغاية للبحث الذي يتضمن الجينات والبيئة والسلوك^5،19. يمنح هذا البروتوكول المستخدم النهائي دليلا بسيطا نسبيا لفحص السلوك الاجتماعي ، وطرق متعددة لقياس السلوك ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.4-l ZT140 Aquaneering tanks	Aquaneering	ZT140	Tanks for social stimulus
Aqueon 20" Deluxe Fluorescent Full Hood aquarium light	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aqueon-aquarium-black-24-fluorescent-deluxe-full-hood-215740		Light for the 37-I tank
Aqueon Standard Open-Glass Glass Aquarium Tank, 10 Gallon	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aga-10g-20x10x12bk-tank-170917		37-l tank for the social assay
Ethanol	Fisher Scienticfic	BP28184
Ethovision XT tracking system	https://www.noldus.com/ethovision-xt
R-Capable Color Basler GigE Camera	https://www.noldus.com/ethovision-xt
White corrugated plastic	https://www.homedepot.com/p/Coroplast-48-in-x-96-in-x-0-157-in-4mm-White-Corrugated-Twinwall-Plastic-Sheet-CP4896S/205351385		Plastic to line the back and the bottom of the 37-I tank and back of the tanks used for the social stimulus