Моделирование расстройств алкогольного спектра плода у рыбок данио с целью охарактеризовать влияние неблагоприятной эмбриональной среды на социальное поведение взрослого человека

Резюме

Цель настоящего протокола состоит в том, чтобы наметить шаги, необходимые для создания и использования теста социальных предпочтений для взрослых рыбок данио, и продемонстрировать, что он может быть использован для характеристики социальных дефектов, вызванных этанолом.

Аннотация

Фетальные расстройства алкогольного спектра (ФАСН) описывают все врожденные дефекты, вызванные алкоголем. Врожденные дефекты, такие как нарушения роста, краниофациальные, поведенческие и когнитивные аномалии, связаны с ФАСН. Социальные трудности являются распространенными поведенческими аномалиями, связанными с ФАСН и часто приводят к серьезным проблемам со здоровьем. Животные модели имеют решающее значение для понимания механизмов, ответственных за социальные дефекты, вызванные этанолом. Данио-рерио — это социальные позвоночные, которые производят внешне оплодотворенные прозрачные яйца; эти характеристики предоставляют исследователям точную, но простую процедуру создания фенотипа ФАСН и врожденного поведения, которое может быть использовано для моделирования социального дефицита, связанного с ФАСН. Таким образом, рыбки данио идеально подходят для характеристики социального дефицита ФАСН. Цель текущего протокола состоит в том, чтобы предоставить пользователю простой поведенческий анализ, который может быть использован для характеристики последствий негативной среды на ранних этапах развития и ее влияния на социальное поведение во взрослой жизни. Протокол может быть использован для характеристики влияния мутаций или тератогенов на социальное поведение взрослого человека. Описанный здесь протокол демонстрирует, как охарактеризовать социальное поведение отдельных рыб во время 20-минутного социального анализа. Кроме того, данные, полученные с использованием настоящего протокола, свидетельствуют о том, что протокол может быть использован для характеристики эффектов социальных дефектов, вызванных эмбриональным этанолом, у взрослых рыбок данио.

Введение

Пренатальное воздействие алкоголя может привести к различным врожденным дефектам, известным как расстройства фетального алкогольного спектра (FASD)¹. Нарушение поведения, такое как социальные трудности, являются распространенными врожденными дефектами, связанными с FASD ^2,3. К сожалению, социальные трудности часто приводят к серьезным проблемам с психическим здоровьем⁴, которые могут негативно повлиять на качество жизни людей с ФАСН. Таким образом, понимание механизмов, ответственных за социальные дефекты, вызванные этанолом, имеет первостепенное значение.

Рыбки данио обладают биологическими и поведенческими характеристиками, которые делают их хорошо подходящими для углубления нашего понимания механизмов, ответственных за социальные дефекты, вызванные этанолом. Например, рыбки данио производят большое количество прозрачных внешне оплодотворенных яиц; эти биологические характеристики позволяют исследователям легко создавать точные и воспроизводимые фенотипы FASD⁵. Чтобы подвергнуть эмбрионы воздействию этанола через 24 часа после оплодотворения (HPF), достаточно использовать препарирующий микроскоп для изучения прозрачной яйцеклетки и определения стадии эмбриона на основе ранее опубликованных работ, таких как Kimmel et ^al.6, а затем поместить яйцеклетку в желаемую концентрацию этанола на желаемый срок. Поскольку хорион является слабым барьером для алкоголя⁷, этанол легко подкупает эмбрион. Чтобы остановить воздействие, нужно просто удалить яйца из раствора этанола. Помимо предоставления исследователям простого, но точного метода создания фенотипов FASD, рыбки данио также позволяют исследователям проводить генетические сравнения с людьми, потому что 70% человеческих генов имеют ортолог рыбок данио, таким образом, они являются ценным инструментом для понимания^генов, связанных с заболеваниями человека. Кроме того, в отличие от других животных моделей, данио-рерио образуют социальные группы⁹ , называемые стаями¹⁰. Поведение отмельчания может быть использовано для характеристики влияния воздействия этанола на эмбрион на социальное поведение¹¹. Кроме того, у рыбок данио рерио социальная реакция может быть вызвана с помощью управляемых компьютером социальных стимулов¹² или живых социальных стимулов¹³.

В предыдущих работах была дана характеристика социальной реакции взрослых рыбок данио в группах¹⁴, однако ограничением этого подхода является невозможность соотнести поведение отдельной рыбы с конкретным показателем, таким как изменения уровня нейротрансмиттеров¹¹. Следующий протокол даст пользователям возможность охарактеризовать социальное поведение отдельной взрослой рыбки данио. Поскольку социальное поведение приобретается для отдельных рыб, пользователи протокола теперь могут соотносить приобретенный поведенческий профиль каждой рыбы с зависимым результатом. Например, предыдущая работа показала, что воздействие этанола на эмбрион ухудшает дофаминергическую реакцию на социальный^{стимул.} В то время как приведенные здесь данные используют воздействие этанола на эмбрион в качестве независимой переменной, пользователи протокола могут охарактеризовать влияние других фармакологических методов лечения или генетических мутаций на социальное поведение. Кроме того, пользователи протокола не ограничиваются изучением того, как эмбриональное лечение изменяет поведение, но также могут определить, как острое фармакологическое лечение взрослых рыбок данио влияет на социальное поведение^.

протокол

Все описанные здесь методы были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Южной Дакоты.

1. Содержание, уход за рыбками данио-рерио и воздействие этанола на эмбрионы

1. Выращивание и разведение данио-рерио в соответствии с описанием¹⁶.
2. Воздействие этанола
   1. Выберите подходящую стадию развития, на которой будет проводиться воздействие этанола. В этом протоколе эмбрионы подвергались воздействию этанола при дозе 24 hpf.
   2. Поместите яйца в 1,0% этанол объем/объем на 2 ч¹⁵. Хорошей практикой является соотношение 1 яйцо на мл ЭМ. В частности, поместите эмбрионы в 50 мл эмбриональной среды (ЭМ; рецепт ЭМ см. в Westerfield¹⁶ ), затем удалите 500 мкл ЭМ и замените 500 мл этанола.
   3. После воздействия этанола вырастить эмбрионы, как описано¹⁷. Анализ социального поведения, когда рыбам исполнилось 16 недель.

2. Рандомизация и настройка аквариума

1. Используя онлайн-генератор случайных последовательностей, рандомизируйте все испытания априори для проведения поведенческих анализов. Убедитесь, что сторона стимула и группы лечения изменяются случайным образом.
2. Чтобы избежать каких-либо искажающих факторов, таких как время суток или день тестирования, начинайте и заканчивайте поведенческий анализ в одно и то же время каждый день и проводите поведенческое тестирование в последовательные дни, пока не будут протестированы все экспериментальные рыбы.
3. Для этого анализа (Рисунок 1) используйте бак объемом 37 л (50 см x 25 см x 30 см, Д x Ш x В) с баками объемом 1,4 л, расположенными снаружи по ширине бака, как описано ранее¹⁷.
4. Выровняйте заднюю часть и дно аквариума объемом 37 л белым гофрированным пластиком, чтобы увеличить контраст между экспериментальной рыбой и фоном для улучшения видеослежения.
5. Поместите гофрированный пластик на внешнюю стенку аквариума объемом 1,4 л, чтобы увеличить контрастность социального стимула для подопытных рыб. Наконец, поместите белый гофрированный пластик между баками объемом 1,4 л и баками 37 л; Этот непрозрачный барьер используется для того, чтобы подопытные рыбы не могли видеть социальный стимул во время привыкания.
6. Расположите камеру на расстоянии, достаточном для захвата всей длины аквариума объемом 37 л плюс половины аквариума объемом 1,4 л и точного отслеживания взрослых подопытных рыб.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдение за тем, какая сторона удерживает стимул, гарантирует, что исследователи правильно пометили зоны слежения и обеспечивает резервирование в качестве резерва.
7. Если инфракрасное отслеживание не используется, обязательно подсвечивайте бак объемом 37 л. Используйте любые имеющиеся в продаже светильники для аквариумных вытяжек с лампой полного спектра T8 мощностью 15 Вт.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если устанавливается несколько арен, используйте идентичные вытяжки для аквариума с идентичными лампами.

3. Проведение социального анализа

1. Начните с заполнения бака объемом 37 л, используемого для поведенческого анализа, водой, идентичной воде, используемой в корпусной стойке. Убедитесь, что температура воды находится в пределах 2 °C от стойки корпуса.
2. В конце дня опустошите бак объемом 37 л. Начинайте каждый день тестирования с пресной воды. Убедитесь, что уровень воды в баке объемом 37 л и уровень воды в баке объемом 1,4 л идентичны. Если температура помещения не позволяет удерживать воду в баке объемом 37 л на уровне 28,5 °C 2 °C, то замените воду теплой водой с температурой 28,5 °C.
3. Далее настройте зоны интереса. Обратитесь к выбранному пользователем программному обеспечению для отслеживания для создания зон. В этом протоколе по длине бака объемом 37 л, сверху и снизу, рулеткой отмечались 5-сантиметровые приращения. Учитывая, что испытательный бак составляет 50 см, шаг в 5 см приводит к 10 зонам по 5 см каждая.
4. Используя в качестве ориентира отметки, сделанные на баке объемом 37 л, используйте программное обеспечение для создания зон, соединив точку 5 см вверху с соответствующей точкой 5 см внизу. Дополнительно создайте зону по дну и вдоль раздражителя. Настройка зон интереса.
5. Используйте программное обеспечение для слежения в этом протоколе для измерения расстояния от зоны и продолжительности пребывания в ней. В этом протоколе было использовано 12 зон.
6. Количественно оцените время, проведенное в зонах с 1 по 10, и расстояние от стимула и дна как зону 1, как зону, ближайшую к стимулу, в то время как зону 10 — самую удаленную от стимула.
7. Затем выберите двух самцов и двух самок, которые будут использоваться для социального стимула. Лучшей практикой было бы использовать самцов и самок из той же когорты, что и подопытные рыбы. Если это невозможно, попытайтесь найти рыбу, которая соответствует штамму, возрасту и размеру подопытной рыбы.
8. Перенесите подопытных рыб из резервуара для содержания в испытательный манеж (резервуар объемом 37 л). Используйте сачок для ловли рыбы в аквариуме с корпусом. Поместите сачок с рыбой в него, в емкость с рыбной водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование этого подхода снизит нагрузку на подопытных рыб при перемещении между аквариумами.
9. Поместите подопытных рыб в центр испытательной арены.
10. Как только настройки обнаружения станут удовлетворительными в зависимости от выбранного пользователем программного обеспечения (см. руководство пользователя), начните 20-минутное испытание. В течение первых 10 минут оставьте на месте непрозрачный барьер между баком объемом 37 л и баком объемом 1,4 л. Это не позволит подопытным рыбам увидеть социальный стимул, состоящий из двух самцов и двух самок данио-рерио, и позволит рыбам акклиматизироваться к испытательной арене^13,17.
11. Через 10 мин осторожно снять непрозрачные преграды, вытащив их из-за бака; Это позволит подопытным рыбам увидеть социальный стимул.
12. Используйте программное обеспечение для слежения для отслеживания и количественной оценки поведения подопытных рыб ^{11, 12, 17} на основе предпочтений пользователя и руководства по программному обеспечению. В текущем протоколе количественно оцените расстояние от социального стимула и дна резервуара, а также время, проведенное во всех зонах.
13. Анализируйте данные с помощью традиционных инструментов анализа данных.

Результаты

Рисунок 2 был модифицирован по материалам Fernandes et ^al.17 и показывает, что воздействие этанола на эмбрион притупляет реакцию отмели за счет изучения расстояния от стимула. Данные на рисунке 2 представляют собой расстояние от с?...

Обсуждение

Рыбки данио-рерио обладают рядом биологических и поведенческих характеристик, что делает их очень привлекательным организмом для исследований, связанных с генами, окружающей средой и поведением ^5,19. Этот протокол дает конечному пользо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.4-l ZT140 Aquaneering tanks	Aquaneering	ZT140	Tanks for social stimulus
Aqueon 20" Deluxe Fluorescent Full Hood aquarium light	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aqueon-aquarium-black-24-fluorescent-deluxe-full-hood-215740		Light for the 37-I tank
Aqueon Standard Open-Glass Glass Aquarium Tank, 10 Gallon	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aga-10g-20x10x12bk-tank-170917		37-l tank for the social assay
Ethanol	Fisher Scienticfic	BP28184
Ethovision XT tracking system	https://www.noldus.com/ethovision-xt
R-Capable Color Basler GigE Camera	https://www.noldus.com/ethovision-xt
White corrugated plastic	https://www.homedepot.com/p/Coroplast-48-in-x-96-in-x-0-157-in-4mm-White-Corrugated-Twinwall-Plastic-Sheet-CP4896S/205351385		Plastic to line the back and the bottom of the 37-I tank and back of the tanks used for the social stimulus