Modélisation des troubles du spectre de l’alcoolisation fœtale chez le poisson-zèbre pour caractériser l’impact d’un environnement embryonnaire défavorable sur le comportement social adulte

Résumé

L’objectif du protocole actuel est de décrire les étapes nécessaires à l’établissement et à l’utilisation d’un test de préférence sociale pour le poisson-zèbre adulte et de démontrer qu’il peut être utilisé pour caractériser les défauts sociaux induits par l’éthanol.

Résumé

L’ensemble des troubles causés par l’alcoolisation fœtale (TSAF) décrit toutes les anomalies congénitales induites par l’alcool. Des anomalies congénitales telles que des troubles de la croissance, des anomalies craniofaciales, comportementales et cognitives sont associées au TSAF. Les difficultés sociales sont des anomalies comportementales courantes associées à l’ETCAF et entraînent souvent de graves problèmes de santé. Les modèles animaux sont essentiels pour comprendre les mécanismes responsables des défauts sociaux induits par l’éthanol. Les poissons-zèbres sont des vertébrés sociaux qui produisent des œufs transparents fécondés de l’extérieur ; ces caractéristiques fournissent aux chercheurs une procédure à la fois précise et simple pour créer le phénotype de l’ETCAF et un comportement inné qui peut être exploité pour modéliser les déficits sociaux associés à l’ETCAF. Ainsi, les poissons-zèbres sont idéaux pour caractériser les déficits sociaux du TSAF. L’objectif du protocole actuel est de fournir à l’utilisateur un test comportemental simple qui peut être utilisé pour caractériser les conséquences d’un environnement négatif au début du développement et les effets qu’il peut avoir sur le comportement social à l’âge adulte. Le protocole peut être utilisé pour caractériser l’effet des mutations ou des tératogènes sur le comportement social adulte. Le protocole décrit ici montre comment caractériser le comportement social d’un poisson individuel au cours d’un essai social de 20 minutes. De plus, les données obtenues à l’aide du protocole actuel fournissent des preuves que le protocole peut être utilisé pour caractériser les effets des anomalies sociales embryonnaires induites par l’éthanol chez les poissons-zèbres adultes.

Introduction

L’exposition prénatale à l’alcool peut entraîner diverses anomalies congénitales connues sous le nom de troubles du spectre de l’alcoolisation fœtale (TSAF)¹. Les troubles du comportement, comme les difficultés sociales, sont des anomalies congénitales courantes associées au TSAF ^2,3. Malheureusement, les difficultés sociales entraînent souvent de graves problèmes de santé mentale⁴, ce qui peut nuire à la qualité de vie des personnes atteintes de l’ETCAF. Ainsi, il est primordial de comprendre les mécanismes responsables des défauts sociaux induits par l’éthanol.

Les poissons-zèbres ont des caractéristiques biologiques et comportementales qui les rendent bien adaptés pour faire progresser notre compréhension des mécanismes responsables des défauts sociaux induits par l’éthanol. Par exemple, le poisson-zèbre produit de grandes quantités d’œufs transparents fécondés à l’extérieur ; ces caractéristiques biologiques permettent aux chercheurs de créer facilement des phénotypes précis et reproductibles de l’ETCAF⁵. Pour exposer des embryons à l’éthanol 24 heures après la fécondation (hpf), il suffit d’utiliser un microscope à dissection pour examiner l’œuf transparent et stadifier l’embryon sur la base de travaux précédemment publiés tels que Kimmel et ^al.6, puis de placer l’œuf à la concentration d’éthanol souhaitée pendant la durée souhaitée. Comme le chorion est une faible barrière à l’alcool⁷, l’éthanol baigne facilement l’embryon. Pour arrêter l’exposition, il suffit de retirer les œufs de la solution d’éthanol. En plus de fournir aux chercheurs une méthode simple mais précise pour créer des phénotypes de l’ETCAF, le poisson-zèbre permet également aux chercheurs de faire des comparaisons génétiques avec les humains, car 70 % des gènes humains ont un orthologue de poisson zèbre, ils sont donc un outil précieux pour comprendre les gènes liés aux maladies humaines⁸. De plus, contrairement à d’autres modèles d’animaux, les poissons-zèbres forment des groupes sociaux⁹ appelés bancs¹⁰. Le comportement de bancs peut être utilisé pour caractériser les effets de l’exposition embryonnaire à l’éthanol sur le comportement social¹¹. De plus, chez le poisson-zèbre, une réponse sociale peut être provoquée en utilisant des stimuli sociaux contrôlés par ordinateur¹² ou un stimulus social en direct¹³.

Des travaux antérieurs ont caractérisé la réponse sociale des poissons-zèbres adultes dans les groupes¹⁴, mais une limite de cette approche est l’incapacité à corréler le comportement d’un poisson individuel avec une mesure spécifique telle que les changements dans les niveaux de neurotransmetteurs¹¹. Le protocole suivant donnera aux utilisateurs la possibilité de caractériser le comportement social d’un poisson-zèbre adulte individuel. Étant donné que le comportement social est acquis pour chaque poisson, les utilisateurs du protocole peuvent désormais corréler le profil comportemental acquis de chaque poisson avec un résultat dépendant. Par exemple, des travaux antérieurs ont montré que l’exposition embryonnaire à l’éthanol altère la réponse dopaminergique à un stimulus social¹¹. Bien que les données présentées ici aient utilisé l’exposition embryonnaire à l’éthanol comme variable indépendante, les utilisateurs du protocole peuvent caractériser les effets d’autres traitements pharmacologiques ou mutations génétiques sur le comportement social. De plus, les utilisateurs du protocole ne sont pas limités à examiner comment les traitements embryonnaires modifient le comportement, mais peuvent également déterminer comment les traitements pharmacologiques aigus chez le poisson-zèbre adulte affectent le comportement social¹⁵.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Dakota du Sud.

1. Logement, soins et exposition à l’éthanol embryonnaire du poisson-zèbre

1. Élever et élever des poissons-zèbres comme décrit¹⁶.
2. Exposition à l’éthanol
   1. Choisissez le stade de développement approprié auquel effectuer l’exposition à l’éthanol. Dans ce protocole, les embryons ont été exposés à l’éthanol à 24 hpf.
   2. Placer les œufs dans 1,0 % d’éthanol volume/volume pendant 2 h¹⁵. Un rapport de 1 œuf par ml d’EM est une bonne pratique. Plus précisément, placez les embryons dans 50 ml de milieu embryonnaire (EM ; veuillez consulter Westerfield¹⁶ pour la recette EM), puis retirez 500 μL d’EM et remplacez-les par 500 μL d’éthanol.
   3. Après l’exposition à l’éthanol, élever les embryons comme décrit¹⁷. Testez le comportement social lorsque les poissons ont 16 semaines.

2. Randomisation et configuration du réservoir

1. À l’aide d’un générateur de séquences aléatoires en ligne, randomisez tous les essais a priori avant de réaliser les tests comportementaux. Assurez-vous que le côté stimulus et les groupes de traitement varient de manière aléatoire.
2. Pour éviter tout facteur de confusion tel que l’heure de la journée ou le jour des tests, commencez et terminez l’essai comportemental à la même heure chaque jour et effectuez les tests comportementaux pendant des jours consécutifs jusqu’à ce que tous les poissons expérimentaux aient été testés.
3. Pour cet essai (figure 1), utiliser une cuve de 37 L (50 cm x 25 cm x 30 cm, L x l x H) avec des cuves de 1,4 L placées à l’extérieur sur la largeur de la cuve, comme décrit précédemment¹⁷.
4. Tapisser l’arrière et le fond du réservoir de 37 L de plastique ondulé blanc pour augmenter le contraste entre le poisson expérimental et l’arrière-plan afin d’améliorer le suivi vidéo.
5. Placez le plastique ondulé sur la paroi extérieure des réservoirs de 1,4 L pour augmenter le contraste du stimulus social pour le poisson expérimental. Enfin, placez du plastique ondulé blanc entre les réservoirs de 1,4 L et les réservoirs de 37 L ; Cette barrière opaque est utilisée pour empêcher le poisson expérimental de voir le stimulus social pendant l’habituation.
6. Placez la caméra à une distance suffisante pour capturer toute la longueur du réservoir de 37 L plus la moitié des réservoirs de 1,4 L et suivre avec précision les poissons adultes de laboratoire.
   REMARQUE : Le fait de voir de quel côté se trouve le stimulus permet de s’assurer que les chercheurs ont correctement étiqueté les zones de suivi et fournit une redondance en tant que sauvegarde.
7. Si aucun suivi infrarouge n’est utilisé, assurez-vous d’éclairer le réservoir de 37 L. Utilisez toutes les lampes de hotte d’aquarium disponibles dans le commerce avec une lampe à spectre complet T8 de 15 W.
   REMARQUE : Si plusieurs arènes sont installées, utilisez des hottes d’aquarium identiques avec des lampes identiques.

3. Réalisation de l’essai social

1. Commencez par remplir le réservoir de 37 L utilisé pour le test comportemental avec de l’eau identique à l’eau utilisée dans le rack du logement. Assurez-vous que la température de l’eau est inférieure à 2 °C du rack du boîtier.
2. À la fin de la journée, videz le réservoir de 37 L. Commencez chaque journée de test avec de l’eau douce. Assurez-vous que le niveau d’eau dans le réservoir de 37 L et le niveau d’eau dans les réservoirs de 1,4 L sont identiques. Si la température de la pièce ne maintient pas l’eau du réservoir de 37 L à 28,5 °C 2 °C, remplacez l’eau par de l’eau tiède à 28,5 °C.
3. Ensuite, configurez les zones d’intérêt. Consultez le manuel d’utilisation du logiciel de suivi de votre choix pour créer des zones. Dans ce protocole, sur toute la longueur de la bouteille de 37 L en haut et en bas, un ruban à mesurer a été utilisé pour marquer les incréments de 5 cm. Étant donné que le réservoir d’essai mesure 50 cm, des incréments de 5 cm conduisent à 10 zones de 5 cm chacune.
4. En utilisant les repères faits sur le réservoir de 37 L comme référence, utilisez le logiciel pour construire les zones en reliant le point de 5 cm en haut au point de 5 cm correspondant en bas. De plus, créez une zone le long du fond et le long du stimulus. Personnalisez les zones d’intérêt.
5. Utilisez le logiciel de suivi de ce protocole pour mesurer la distance d’une zone et le temps passé dans la zone. Dans ce protocole, 12 zones ont été utilisées.
6. Quantifiez le temps passé dans les zones 1 à 10 et la distance entre le stimulus et le bas comme la zone 1, comme la zone la plus proche du stimulus tandis que la zone 10 est la plus éloignée du stimulus.
7. Ensuite, sélectionnez les deux mâles et les deux femelles qui seront utilisés pour le stimulus social. La meilleure pratique serait d’utiliser des mâles et des femelles de la même cohorte que les poissons expérimentaux. Si ce n’est pas possible, essayez de trouver des poissons qui correspondent à la souche, à l’âge et à la taille du poisson expérimental.
8. Transférez les poissons expérimentaux du réservoir du logement à l’arène d’essai (réservoir de 37 L). Utilisez un filet pour attraper les poissons dans le réservoir du logement. Placez le filet avec les poissons à l’intérieur, dans un récipient avec de l’eau de poisson.
   REMARQUE : L’utilisation de cette approche réduira le stress des poissons expérimentaux lorsqu’ils se déplacent entre les réservoirs.
9. Placez le poisson expérimental au centre de l’arène de test.
10. Une fois que les paramètres de détection sont satisfaisants en fonction du logiciel choisi par l’utilisateur (voir le manuel d’utilisation), commencez l’essai de 20 minutes. Pendant les 10 premières minutes, laissez en place la barrière opaque entre le réservoir de 37 L et les réservoirs de 1,4 L. Cela empêchera le poisson expérimental de voir le stimulus social, composé de deux poissons-zèbres mâles et de deux poissons-zèbres femelles, et permettra aux poissons de s’acclimater à l’arène d’essai^13,17.
11. Après 10 min, retirez soigneusement les barrières opaques en les tirant de l’arrière du réservoir ; Cela permettra aux poissons expérimentaux de voir le stimulus social.
12. Utilisez un logiciel de suivi pour suivre et quantifier le comportement du poisson expérimental ^{11, 12, 17} en fonction des préférences de l’utilisateur et du manuel du logiciel. Dans le protocole actuel, quantifiez la distance entre le stimulus social et le fond du réservoir ainsi que le temps passé dans toutes les zones.
13. Analysez les données à l’aide d’outils d’analyse de données traditionnels.

Résultats

La figure 2 a été modifiée à partir de Fernandes et ^al.17 et montre que l’exposition à l’éthanol embryonnaire atténue la réponse de haut-fond en examinant la distance par rapport au stimulus. Les données de la figure 2 représentent la distance par rapport au stimulus social pendant l’essai de 20 minutes. L’axe Y indique la distance en centimètres tandis que l’axe X montre l’essai de...

Discussion

Le poisson-zèbre a un certain nombre de caractéristiques biologiques et comportementales qui en font un organisme très attrayant pour la recherche impliquant les gènes, l’environnement et le comportement ^5,19. Ce protocole donne à l’utilisateur final un guide relativement simple pour tester le comportement social, plusieurs façons de quantifier le comportement social, et a le potentiel de relier les réponses comporteme...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.4-l ZT140 Aquaneering tanks	Aquaneering	ZT140	Tanks for social stimulus
Aqueon 20" Deluxe Fluorescent Full Hood aquarium light	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aqueon-aquarium-black-24-fluorescent-deluxe-full-hood-215740		Light for the 37-I tank
Aqueon Standard Open-Glass Glass Aquarium Tank, 10 Gallon	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aga-10g-20x10x12bk-tank-170917		37-l tank for the social assay
Ethanol	Fisher Scienticfic	BP28184
Ethovision XT tracking system	https://www.noldus.com/ethovision-xt
R-Capable Color Basler GigE Camera	https://www.noldus.com/ethovision-xt
White corrugated plastic	https://www.homedepot.com/p/Coroplast-48-in-x-96-in-x-0-157-in-4mm-White-Corrugated-Twinwall-Plastic-Sheet-CP4896S/205351385		Plastic to line the back and the bottom of the 37-I tank and back of the tanks used for the social stimulus