Modelado de trastornos del espectro alcohólico fetal en pez cebra para caracterizar el impacto de un entorno embrionario adverso en el comportamiento social adulto

Resumen

El objetivo del protocolo actual es esbozar los pasos necesarios para establecer y utilizar un ensayo de preferencia social para el pez cebra adulto y demostrar que puede utilizarse para caracterizar los defectos sociales inducidos por el etanol.

Resumen

Los trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF) describen todos los defectos congénitos inducidos por el alcohol. Los defectos congénitos, como las deficiencias de crecimiento, las anomalías craneofaciales, conductuales y cognitivas, se asocian con el TEAF. Las dificultades sociales son anormalidades comunes del comportamiento asociadas con el TEAF y, a menudo, resultan en problemas de salud graves. Los modelos animales son fundamentales para comprender los mecanismos responsables de los defectos sociales inducidos por el etanol. Los peces cebra son vertebrados sociales que producen huevos transparentes fertilizados externamente; estas características proporcionan a los investigadores un procedimiento preciso pero simple para crear el fenotipo de TEAF y un comportamiento innato que se puede aprovechar para modelar los déficits sociales asociados con el TEAF. Por lo tanto, los peces cebra son ideales para caracterizar los déficits sociales del TEAF. El objetivo del protocolo actual es proporcionar al usuario un ensayo conductual simple que se pueda utilizar para caracterizar las consecuencias de un entorno negativo temprano durante el desarrollo y los efectos que puede tener en el comportamiento social en la edad adulta. El protocolo se puede utilizar para caracterizar el efecto que las mutaciones o los teratógenos tienen en el comportamiento social de los adultos. El protocolo descrito aquí demuestra cómo caracterizar el comportamiento social de peces individuales durante un ensayo social de 20 minutos. Además, los datos obtenidos utilizando el protocolo actual proporcionan evidencia de que el protocolo se puede utilizar para caracterizar los efectos de los defectos sociales inducidos por etanol embrionario en peces cebra adultos.

Introducción

La exposición prenatal al alcohol puede provocar una variedad de defectos congénitos conocidos colectivamente como trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF)¹. El deterioro del comportamiento, como las dificultades sociales, son defectos congénitos comunes asociados con el TEAF ^2,3. Desafortunadamente, las dificultades sociales con frecuencia resultan en serios problemas de salud mental⁴, que pueden afectar negativamente la calidad de vida de las personas con TEAF. Por lo tanto, es primordial comprender los mecanismos responsables de los defectos sociales inducidos por el etanol.

El pez cebra tiene características biológicas y de comportamiento que lo hacen muy adecuado para avanzar en nuestra comprensión de los mecanismos responsables de los defectos sociales inducidos por el etanol. Por ejemplo, el pez cebra produce grandes cantidades de huevos transparentes fertilizados externamente; estas características biológicas permiten a los investigadores crear fácilmente fenotipos precisos y replicables de TEAF⁵. Para exponer los embriones al etanol a las 24 h después de la fertilización (hpf), simplemente se tiene que utilizar un microscopio de disección para examinar el óvulo transparente y estadificar el embrión basándose en trabajos publicados previamente como Kimmel et ^al.6, y luego colocar el óvulo en la concentración de etanol deseada durante el tiempo deseado. Dado que el corion es una barrera débil contra el alcohol⁷, el etanol baña fácilmente al embrión. Para detener la exposición, simplemente hay que retirar los huevos de la solución de etanol. Además de proporcionar a los investigadores un método simple pero preciso para crear fenotipos de TEAF, el pez cebra también permite a los investigadores hacer comparaciones genéticas con los humanos porque el 70% de los genes humanos tienen un ortólogo de pez cebra, por lo que son una herramienta valiosa para^{comprender los genes} relacionados con las enfermedades humanas. Además, a diferencia de otros modelos animales, el pez cebra forma grupos sociales⁹ llamados cardúmenes¹⁰. El comportamiento de cardumen puede utilizarse para caracterizar los efectos que la exposición embrionaria al etanol tiene sobre el comportamiento social¹¹. Además, en el pez cebra se puede provocar una respuesta social mediante el uso de estímulos sociales controlados por computadora¹² o un estímulo social en vivo¹³.

Trabajos previos han caracterizado la respuesta social del pez cebra adulto en grupos¹⁴, sin embargo, una limitación de este enfoque es la incapacidad de correlacionar el comportamiento de un pez individual con una medida específica como los cambios en los niveles de neurotransmisores¹¹. El siguiente protocolo dará a los usuarios la capacidad de caracterizar el comportamiento social de un pez cebra adulto individual. Dado que el comportamiento social se adquiere para peces individuales, los usuarios del protocolo ahora pueden correlacionar el perfil de comportamiento adquirido de cada pez con un resultado dependiente. Por ejemplo, trabajos previos han demostrado que la exposición embrionaria al etanol altera la respuesta dopaminérgica a un estímulo social¹¹. Si bien los datos mostrados aquí han utilizado la exposición embrionaria al etanol como variable independiente, los usuarios del protocolo pueden caracterizar los efectos que otros tratamientos farmacológicos o mutaciones genéticas tienen en el comportamiento social. Además, los usuarios del protocolo no se limitan a examinar cómo los tratamientos embrionarios alteran el comportamiento, sino que también pueden determinar cómo los tratamientos farmacológicos agudos en el pez cebra adulto impactan el comportamiento social¹⁵.

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Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Dakota del Sur.

1. Alojamiento, cuidado y exposición al etanol embrionario del pez cebra

1. Cría y cría peces cebra como se describe¹⁶.
2. Exposición al etanol
   1. Elija la etapa de desarrollo apropiada en la que se llevará a cabo la exposición al etanol. En este protocolo, los embriones fueron expuestos a etanol a 24 hpf.
   2. Coloque los huevos en un volumen de etanol al 1,0% durante 2 h¹⁵. Una proporción de 1 huevo por mL de EM es una buena práctica. Específicamente, coloque los embriones en 50 mL de medio embrionario (EM; consulte Westerfield¹⁶ para la receta de EM), luego retire 500 μL de EM y reemplácelos con 500 μL de etanol.
   3. Después de la exposición al etanol, cría embriones como se describe¹⁷. Evalúe el comportamiento social cuando los peces tienen 16 semanas de edad.

2. Aleatorización y configuración del tanque

1. Utilizando un generador de secuencias aleatorias en línea, aleatorice todos los ensayos a priori para realizar los ensayos de comportamiento. Asegúrese de que el lado del estímulo y los grupos de tratamiento varíen aleatoriamente.
2. Para evitar cualquier factor de confusión, como la hora del día o el día de la prueba, comience y finalice el ensayo de comportamiento a la misma hora todos los días y realice la prueba de comportamiento en días consecutivos hasta que se hayan realizado todas las pruebas de peces experimentales.
3. Para este ensayo (Figura 1), utilice un tanque de 37 L (50 cm x 25 cm x 30 cm, L x W x H) con tanques de 1,4 L colocados en el exterior a lo largo del ancho del tanque como se describió anteriormente¹⁷.
4. Cubra la parte posterior y el fondo del tanque de 37 L con plástico corrugado blanco para aumentar el contraste entre los peces experimentales y el fondo para mejorar el seguimiento del video.
5. Coloque el plástico corrugado en la pared exterior de los tanques de 1,4 L para aumentar el contraste del estímulo social para los peces experimentales. Por último, coloque plástico corrugado blanco entre los tanques de 1,4 L y los tanques de 37 L; Esta barrera opaca se utiliza para evitar que los peces experimentales vean el estímulo social durante la habituación.
6. Coloque la cámara a una distancia lo suficientemente larga como para capturar toda la longitud del tanque de 37 L más la mitad de los tanques de 1,4 L y realizar un seguimiento preciso de los peces experimentales adultos.
   NOTA: Ver qué lado contiene el estímulo garantiza que los investigadores hayan etiquetado correctamente las zonas de seguimiento y proporciona redundancia como respaldo.
7. Si no se utiliza ningún seguimiento por infrarrojos, asegúrese de iluminar el depósito de 37 L. Utilice cualquier luz de campana de acuario disponible en el mercado con una lámpara de espectro completo T8 de 15 W.
   NOTA: Si se están configurando varias arenas, use campanas de acuario idénticas con lámparas idénticas.

3. Realización del ensayo social

1. Comience llenando el tanque de 37 L utilizado para el ensayo de comportamiento con agua que sea idéntica al agua utilizada en el estante de la carcasa. Asegúrese de que la temperatura del agua esté dentro de los 2 °C de la rejilla de la carcasa.
2. Al final del día, vacíe el tanque de 37 L. Comience cada día de prueba con agua fresca. Asegúrese de que el nivel de agua en el tanque de 37 L y el nivel de agua en los tanques de 1,4 L sean idénticos. Si la temperatura de la habitación no mantiene el agua en el tanque de 37 L a 28,5 °C 2 °C, reemplace el agua con agua tibia a 28,5 °C.
3. A continuación, configure las zonas de interés. Consulte el software de seguimiento manual del usuario de su elección para crear zonas. En este protocolo, a lo largo de la longitud del tanque de 37 L en la parte superior e inferior, se utilizó una cinta métrica para marcar incrementos de 5 cm. Dado que el tanque de prueba es de 50 cm, los incrementos de 5 cm conducen a 10 zonas de 5 cm cada una.
4. Tomando como referencia las marcas hechas en el tanque de 37 L, use el software para construir las zonas conectando el punto de 5 cm en la parte superior con el punto correspondiente de 5 cm en la parte inferior. Además, crea una zona a lo largo de la parte inferior y a lo largo del estímulo. Personaliza las zonas de interés.
5. Utilice el software de seguimiento de este protocolo para medir la distancia desde una zona y el tiempo que se pasa en la zona. En este protocolo se utilizaron 12 zonas.
6. Cuantifica el tiempo de permanencia en las zonas 1 a 10 y la distancia al estímulo y la parte inferior como Zona 1, como la zona más cercana al estímulo, mientras que la Zona 10 es la más alejada del estímulo.
7. A continuación, seleccione los dos machos y las dos hembras que se utilizarán para el estímulo social. La mejor práctica sería utilizar machos y hembras de la misma cohorte que los peces experimentales. Si eso no es posible, trate de encontrar peces que coincidan con la cepa, la edad y el tamaño de los peces experimentales.
8. Transfiera los peces experimentales del tanque de alojamiento al campo de pruebas (tanque de 37 L). Use una red para atrapar los peces en el tanque de la vivienda. Coloque la red con los peces en ella, en un recipiente con agua para peces.
   NOTA: El uso de este enfoque reducirá el estrés en los peces experimentales mientras se mueven entre tanques.
9. Coloque el pez experimental en el centro de la arena de prueba.
10. Una vez que la configuración de detección sea satisfactoria según el software elegido por el usuario (consulte el manual del usuario), comience la prueba de 20 minutos. Durante los primeros 10 minutos, deje la barrera opaca entre el tanque de 37 L y el tanque de 1,4 L en su lugar. Esto evitará que los peces experimentales vean el estímulo social, compuesto por dos peces cebra machos y dos hembras, y permitirá que los peces se aclimaten a la arena de prueba^13,17.
11. Después de 10 minutos, retire con cuidado las barreras opacas tirando de ellas desde detrás del tanque; Esto permitirá a los peces experimentales ver el estímulo social.
12. Utilice un software de seguimiento para rastrear y cuantificar el comportamiento de los peces experimentales ^{11, 12, 17} en función de las preferencias del usuario y el manual del software. En el protocolo actual, cuantificar la distancia entre el estímulo social y el fondo del tanque, así como el tiempo de permanencia en todas las zonas.
13. Analice los datos utilizando herramientas tradicionales de análisis de datos.

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Resultados

La Figura 2 ha sido modificada de Fernandes et ^al.17 y muestra que la exposición embrionaria al etanol atenua la respuesta de cardumen al examinar la distancia desde el estímulo. Los datos de la Figura 2 representan la distancia con el estímulo social durante el ensayo de 20 minutos. El eje Y muestra la distancia en centímetros, mientras que el eje X muestra la prueba de 20 minutos dividida en interva...

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Discusión

El pez cebra tiene una serie de características biológicas y de comportamiento que lo convierten en un organismo muy atractivo para la investigación que involucra los genes, el medio ambiente y el comportamiento ^5,19. Este protocolo proporciona al usuario final una guía relativamente sencilla para analizar el comportamiento social, múltiples formas de cuantificar el comportamiento social, y tiene el potencial de vincular las...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.4-l ZT140 Aquaneering tanks	Aquaneering	ZT140	Tanks for social stimulus
Aqueon 20" Deluxe Fluorescent Full Hood aquarium light	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aqueon-aquarium-black-24-fluorescent-deluxe-full-hood-215740		Light for the 37-I tank
Aqueon Standard Open-Glass Glass Aquarium Tank, 10 Gallon	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aga-10g-20x10x12bk-tank-170917		37-l tank for the social assay
Ethanol	Fisher Scienticfic	BP28184
Ethovision XT tracking system	https://www.noldus.com/ethovision-xt
R-Capable Color Basler GigE Camera	https://www.noldus.com/ethovision-xt
White corrugated plastic	https://www.homedepot.com/p/Coroplast-48-in-x-96-in-x-0-157-in-4mm-White-Corrugated-Twinwall-Plastic-Sheet-CP4896S/205351385		Plastic to line the back and the bottom of the 37-I tank and back of the tanks used for the social stimulus