Modelagem de distúrbios do espectro alcoólico fetal em peixe-zebra para caracterizar o impacto de um ambiente embrionário adverso no comportamento social adulto

Resumo

O objetivo do protocolo atual é delinear as etapas necessárias para estabelecer e usar um ensaio de preferência social para peixes-zebra adultos e demonstrar que ele pode ser usado para caracterizar defeitos sociais induzidos por etanol.

Resumo

Os transtornos do espectro alcoólico fetal (FASD) descrevem todos os defeitos congênitos induzidos pelo álcool. Defeitos congênitos, como deficiências de crescimento, anormalidades craniofaciais, comportamentais e cognitivas, estão associados ao FASD. As dificuldades sociais são anormalidades comportamentais comuns associadas ao FASD e muitas vezes resultam em sérios problemas de saúde. Modelos animais são fundamentais para a compreensão dos mecanismos responsáveis pelos defeitos sociais induzidos pelo etanol. O peixe-zebra é um vertebrado social que produz ovos transparentes fertilizados externamente; essas características fornecem aos pesquisadores um procedimento preciso, porém simples, para criar o fenótipo FASD e um comportamento inato que pode ser aproveitado para modelar os déficits sociais associados ao FASD. Assim, o peixe-zebra é ideal para caracterizar os déficits sociais do FASD. O objetivo do protocolo atual é fornecer ao usuário um ensaio comportamental simples que possa ser usado para caracterizar as consequências de um ambiente negativo no início do desenvolvimento e os efeitos que ele pode ter no comportamento social na idade adulta. O protocolo pode ser usado para caracterizar o efeito que as mutações ou teratógenos têm no comportamento social adulto. O protocolo descrito aqui demonstra como caracterizar o comportamento social de peixes individuais durante um ensaio social de 20 minutos. Além disso, os dados obtidos usando o protocolo atual fornecem evidências de que o protocolo pode ser usado para caracterizar os efeitos de defeitos sociais induzidos por etanol embrionário em peixes-zebra adultos.

Introdução

A exposição pré-natal ao álcool pode levar a uma variedade de defeitos congênitos conhecidos coletivamente como transtornos do espectro alcoólico fetal (FASD)¹. Comportamento prejudicado, como dificuldades sociais, são defeitos congênitos comuns associados ao FASD ^2,3. Infelizmente, as dificuldades sociais frequentemente resultam em sérios problemas de saúde mental⁴, o que pode afetar adversamente a qualidade de vida dos indivíduos com TEAF. Assim, entender os mecanismos responsáveis pelos defeitos sociais induzidos pelo etanol é fundamental.

O peixe-zebra tem características biológicas e comportamentais que os tornam adequados para avançar nossa compreensão dos mecanismos responsáveis pelos defeitos sociais induzidos pelo etanol. Por exemplo, o peixe-zebra produz grandes quantidades de ovos transparentes fertilizados externamente; essas características biológicas permitem que os pesquisadores criem facilmente fenótipos FASD precisos e replicáveis⁵. Para expor os embriões ao etanol 24 h após a fertilização (hpf), basta usar um microscópio de dissecação para examinar o óvulo transparente e estadiar o embrião com base em trabalhos publicados anteriormente, como Kimmel et ^al.6, e depois colocar o óvulo na concentração desejada de etanol pela duração desejada. Como o córion é uma barreira fraca ao álcool⁷, o etanol banha prontamente o embrião. Para interromper a exposição, basta remover os ovos da solução de etanol. Além de fornecer aos pesquisadores um método simples, mas preciso, para criar fenótipos de FASD, o peixe-zebra também permite que os pesquisadores façam comparações genéticas com humanos, porque 70% dos genes humanos têm um ortólogo de peixe-zebra, portanto, são uma ferramenta valiosa para entender os genes relacionados a doenças humanas⁸. Além disso, ao contrário de outros modelos animais, o peixe-zebra forma grupos sociais⁹ chamados cardumes¹⁰. O comportamento de cardume pode ser usado para caracterizar os efeitos que a exposição embrionária ao etanol tem no comportamento social¹¹. Além disso, no peixe-zebra, uma resposta social pode ser provocada usando estímulos sociais controlados por computador¹² ou um estímulo social ao vivo¹³.

Trabalhos anteriores caracterizaram a resposta social do peixe-zebra adulto em grupos¹⁴, no entanto, uma limitação dessa abordagem é a incapacidade de correlacionar o comportamento de um peixe individual com uma medida específica, como mudanças nos níveis de neurotransmissores¹¹. O protocolo a seguir dará aos usuários a capacidade de caracterizar o comportamento social de um peixe-zebra adulto individual. Como o comportamento social é adquirido para peixes individuais, os usuários do protocolo agora podem correlacionar o perfil comportamental adquirido de cada peixe com um resultado dependente. Por exemplo, trabalhos anteriores mostraram que a exposição embrionária ao etanol prejudica a resposta dopaminérgica a um estímulo social¹¹. Embora os dados mostrados aqui tenham usado a exposição embrionária ao etanol como variável independente, os usuários do protocolo podem caracterizar os efeitos que outros tratamentos farmacológicos ou mutações genéticas têm no comportamento social. Além disso, os usuários do protocolo não se limitam a examinar como os tratamentos embrionários alteram o comportamento, mas também podem determinar como os tratamentos farmacológicos agudos em peixes-zebra adultos afetam o comportamento social¹⁵.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Dakota do Sul.

1. Alojamento, cuidados e exposição ao etanol embrionário do peixe-zebra

1. Crie e crie peixes-zebra conforme descrito¹⁶.
2. Exposição ao etanol
   1. Escolha o estágio de desenvolvimento apropriado para conduzir a exposição ao etanol. Neste protocolo, os embriões foram expostos ao etanol a 24 hpf.
   2. Coloque os ovos em 1,0% de etanol volume / volume por 2 h¹⁵. Uma proporção de 1 ovo por mL de EM é uma boa prática. Especificamente, coloque os embriões em 50 mL de meio embrionário (EM; consulte Westerfield¹⁶ para a receita EM), remova 500 μL de EM e substitua por 500 μL de etanol.
   3. Após a exposição ao etanol, crie embriões conforme descrito¹⁷. Ensaio de comportamento social quando os peixes têm 16 semanas de idade.

2. Randomização e configuração do tanque

1. Usando um gerador de sequência aleatória online, randomize todos os ensaios a priori para conduzir os ensaios comportamentais. Certifique-se de que o lado do estímulo e os grupos de tratamento variem aleatoriamente.
2. Para evitar fatores de confusão, como hora do dia ou dia do teste, inicie e termine o ensaio comportamental no mesmo horário todos os dias e realize o teste comportamental em dias consecutivos até que todos os peixes experimentais tenham sido testados.
3. Para este ensaio (Figura 1), use um tanque de 37 L (50 cm x 25 cm x 30 cm, C x L x A) com tanques de 1,4 L colocados do lado de fora ao longo da largura do tanque, conforme descrito anteriormente¹⁷.
4. Forre a parte traseira e o fundo do tanque de 37 L com plástico corrugado branco para aumentar o contraste entre os peixes experimentais e o fundo para melhorar o rastreamento de vídeo.
5. Coloque o plástico corrugado na parede externa dos tanques de 1,4 L para aumentar o contraste do estímulo social para os peixes experimentais. Por fim, coloque plástico corrugado branco entre os tanques de 1,4 L e os tanques de 37 L; Essa barreira opaca é usada para evitar que os peixes experimentais vejam o estímulo social durante a habituação.
6. Coloque a câmera a uma distância suficiente para capturar todo o comprimento do tanque de 37 L mais metade dos tanques de 1,4 L e rastrear com precisão os peixes experimentais adultos.
   NOTA: Ver qual lado contém o estímulo garante que os pesquisadores rotularam as zonas de rastreamento corretamente e fornece redundância como backup.
7. Se nenhum rastreamento infravermelho estiver sendo usado, certifique-se de iluminar o tanque de 37 L. Use qualquer luz de exaustor de aquário disponível comercialmente com uma lâmpada de espectro total T8 de 15 W.
   NOTA: Se várias arenas estiverem sendo montadas, use exaustores de aquário idênticos com lâmpadas idênticas.

3. Realização do ensaio social

1. Comece enchendo o tanque de 37 L usado para o ensaio comportamental com água idêntica à água usada no rack do alojamento. Certifique-se de que a temperatura da água esteja dentro de 2 °C do rack da caixa.
2. No final do dia, esvazie o tanque de 37 L. Comece cada dia de teste com água fresca. Certifique-se de que o nível de água no tanque de 37 L e o nível de água nos tanques de 1.4 L sejam idênticos. Se a temperatura da sala não mantiver a água no tanque de 37 L a 28.5 °C 2 °C, substitua a água por água morna a 28.5 °C.
3. Em seguida, configure as zonas de interesse. Consulte o software de rastreamento manual do usuário de sua escolha para criar zonas. Neste protocolo, ao longo do comprimento do tanque de 37 L na parte superior e inferior, foi utilizada uma fita métrica para marcar incrementos de 5 cm. Dado que o tanque de teste é de 50 cm, incrementos de 5 cm levam a 10 zonas de 5 cm cada.
4. Usando as marcas feitas no tanque de 37 L como referência, use o software para construir as zonas conectando o ponto de 5 cm na parte superior ao ponto correspondente de 5 cm na parte inferior. Além disso, crie uma zona ao longo da parte inferior e ao longo do estímulo. Personalize zonas de interesse.
5. Use o software de rastreamento neste protocolo para medir a distância de uma zona e a duração gasta na zona. Neste protocolo, foram utilizadas 12 zonas.
6. Quantifique o tempo gasto nas zonas 1 a 10 e a distância do estímulo e do fundo como a Zona 1, como a zona mais próxima do estímulo, enquanto a Zona 10 é a mais distante do estímulo.
7. Em seguida, selecione os dois machos e duas fêmeas que serão usados para o estímulo social. A melhor prática seria usar machos e fêmeas da mesma coorte que os peixes experimentais. Se isso não for possível, tente encontrar peixes que correspondam à linhagem, idade e tamanho dos peixes experimentais.
8. Transferir o peixe experimental do tanque de alojamento para a arena de teste (tanque de 37 L). Use uma rede para pegar os peixes no tanque de alojamento. Coloque a rede com o peixe em um recipiente com água de peixe.
   NOTA: O uso desta abordagem reduzirá o estresse nos peixes experimentais enquanto se movem entre os tanques.
9. Coloque os peixes experimentais no centro da arena de teste.
10. Assim que as configurações de detecção forem satisfatórias com base no software escolhido pelo usuário (consulte o manual do usuário), inicie o teste de 20 minutos. Durante os primeiros 10 minutos, deixe a barreira opaca entre o tanque de 37 L e os tanques de 1,4 L no lugar. Isso impedirá que os peixes experimentais vejam o estímulo social, composto por dois peixes-zebra machos e duas fêmeas, e permitirá que os peixes se aclimatem à arena de testes^13,17.
11. Após 10 min, remova cuidadosamente as barreiras opacas, puxando-as por trás do tanque; Isso permitirá que os peixes experimentais vejam o estímulo social.
12. Use o software de rastreamento para rastrear e quantificar o comportamento dos peixes experimentais ^{11, 12, 17} com base nas preferências do usuário e no manual do software. No protocolo atual, quantifique a distância do estímulo social e do fundo do tanque, bem como o tempo gasto em todas as zonas.
13. Analise dados usando ferramentas tradicionais de análise de dados.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

A Figura 2 foi modificada de Fernandes et ^al.17 e mostra que a exposição embrionária ao etanol embota a resposta de cardume examinando a distância do estímulo. Os dados da Figura 2 representam a distância do estímulo social durante o teste de 20 minutos. O eixo Y mostra a distância em centímetros, enquanto o eixo X mostra o teste de 20 minutos dividido em intervalos de 1 minuto. A barra preta ao ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

O peixe-zebra possui uma série de características biológicas e comportamentais, tornando-o um organismo altamente atraente para pesquisas envolvendo genes, meio ambiente e comportamento ^5,19. Este protocolo fornece ao usuário final um guia relativamente simples para testar o comportamento social, várias maneiras de quantificar o comportamento social e tem o potencial de vincular as respostas comportamentais de peixes individ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.4-l ZT140 Aquaneering tanks	Aquaneering	ZT140	Tanks for social stimulus
Aqueon 20" Deluxe Fluorescent Full Hood aquarium light	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aqueon-aquarium-black-24-fluorescent-deluxe-full-hood-215740		Light for the 37-I tank
Aqueon Standard Open-Glass Glass Aquarium Tank, 10 Gallon	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aga-10g-20x10x12bk-tank-170917		37-l tank for the social assay
Ethanol	Fisher Scienticfic	BP28184
Ethovision XT tracking system	https://www.noldus.com/ethovision-xt
R-Capable Color Basler GigE Camera	https://www.noldus.com/ethovision-xt
White corrugated plastic	https://www.homedepot.com/p/Coroplast-48-in-x-96-in-x-0-157-in-4mm-White-Corrugated-Twinwall-Plastic-Sheet-CP4896S/205351385		Plastic to line the back and the bottom of the 37-I tank and back of the tanks used for the social stimulus