Modellazione dei disturbi dello spettro alcolico fetale nel pesce zebra per caratterizzare l'impatto di un ambiente embrionale avverso sul comportamento sociale adulto

Riepilogo

L'obiettivo dell'attuale protocollo è quello di delineare i passaggi necessari per stabilire e utilizzare un test di preferenza sociale per il pesce zebra adulto e dimostrare che può essere utilizzato per caratterizzare i difetti sociali indotti dall'etanolo.

Abstract

I disturbi dello spettro alcolico fetale (FASD) descrivono tutti i difetti alla nascita indotti dall'alcol. Difetti alla nascita come deficit di crescita, anomalie craniofacciali, comportamentali e cognitive sono associati alla FASD. Le difficoltà sociali sono anomalie comportamentali comuni associate alla FASD e spesso provocano gravi problemi di salute. I modelli animali sono fondamentali per comprendere i meccanismi responsabili dei difetti sociali indotti dall'etanolo. I pesci zebra sono vertebrati sociali che producono uova trasparenti fecondate esternamente; queste caratteristiche forniscono ai ricercatori una procedura precisa ma semplice per creare il fenotipo FASD e un comportamento innato che può essere sfruttato per modellare i deficit sociali associati alla FASD. Pertanto, i pesci zebra sono ideali per caratterizzare i deficit sociali della FASD. L'obiettivo dell'attuale protocollo è quello di fornire all'utente un semplice test comportamentale che possa essere utilizzato per caratterizzare le conseguenze di un ambiente negativo all'inizio dello sviluppo e gli effetti che può avere sul comportamento sociale in età adulta. Il protocollo può essere utilizzato per caratterizzare l'effetto che le mutazioni o i teratogeni hanno sul comportamento sociale degli adulti. Il protocollo qui delineato dimostra come caratterizzare il comportamento sociale dei singoli pesci durante un saggio sociale di 20 minuti. Inoltre, i dati ottenuti utilizzando l'attuale protocollo forniscono la prova che il protocollo può essere utilizzato per caratterizzare gli effetti dei difetti sociali indotti dall'etanolo embrionale negli zebrafish adulti.

Introduzione

L'esposizione prenatale all'alcol può portare a una varietà di difetti alla nascita noti collettivamente come disturbi dello spettro alcolico fetale (FASD)¹. Il comportamento alterato, come le difficoltà sociali, sono difetti alla nascita comuni associati alla FASD ^2,3. Sfortunatamente, le difficoltà sociali spesso si traducono in gravi problemi di salute mentale⁴, che possono influire negativamente sulla qualità della vita delle persone con FASD. Pertanto, è fondamentale comprendere i meccanismi responsabili dei difetti sociali indotti dall'etanolo.

I pesci zebra hanno caratteristiche biologiche e comportamentali che li rendono adatti a far progredire la nostra comprensione dei meccanismi responsabili dei difetti sociali indotti dall'etanolo. Ad esempio, il pesce zebra produce grandi quantità di uova trasparenti fecondate esternamente; queste caratteristiche biologiche consentono ai ricercatori di creare facilmente fenotipi FASD precisi e replicabili⁵. Per esporre gli embrioni all'etanolo a 24 ore dopo la fecondazione (hpf), è sufficiente utilizzare un microscopio da dissezione per esaminare l'ovulo trasparente e mettere in scena l'embrione sulla base di lavori precedentemente pubblicati come Kimmel et ^al.6, quindi posizionare l'ovulo nella concentrazione di etanolo desiderata per la durata desiderata. Poiché il corion è una debole barriera all'alcol⁷, l'etanolo bagna facilmente l'embrione. Per fermare l'esposizione, è sufficiente rimuovere le uova dalla soluzione di etanolo. Oltre a fornire ai ricercatori un metodo semplice ma accurato per creare fenotipi di FASD, il pesce zebra consente anche ai ricercatori di fare confronti genetici con gli esseri umani perché il 70% dei geni umani ha un ortologo del pesce zebra, quindi sono uno strumento prezioso per comprendere i geni correlati alle malattie umane⁸. Inoltre, a differenza di altri modelli animali, il pesce zebra forma gruppi sociali⁹ chiamati banchi¹⁰. Il comportamento di Shoaling può essere utilizzato per caratterizzare gli effetti che l'esposizione all'etanolo embrionale ha sul comportamento sociale¹¹. Inoltre, nel pesce zebra una risposta sociale può essere suscitata utilizzando stimoli sociali controllati dal computer¹² o uno stimolo sociale dal vivo¹³.

Lavori precedenti hanno caratterizzato la risposta sociale del pesce zebra adulto nei gruppi¹⁴, tuttavia una limitazione di questo approccio è l'incapacità di correlare il comportamento di un singolo pesce con una misura specifica come i cambiamenti nei livelli di neurotrasmettitore¹¹. Il seguente protocollo darà agli utenti la possibilità di caratterizzare il comportamento sociale di un singolo pesce zebra adulto. Poiché il comportamento sociale viene acquisito per i singoli pesci, gli utenti del protocollo possono ora correlare il profilo comportamentale acquisito di ciascun pesce con un risultato dipendente. Ad esempio, lavori precedenti hanno dimostrato che l'esposizione all'etanolo embrionale compromette la risposta dopaminergica a uno stimolo sociale¹¹. Mentre i dati mostrati qui hanno utilizzato l'esposizione all'etanolo embrionale come variabile indipendente, gli utenti del protocollo possono caratterizzare gli effetti che altri trattamenti farmacologici o mutazioni genetiche hanno sul comportamento sociale. Inoltre, gli utenti del protocollo non si limitano a esaminare come i trattamenti embrionali alterano il comportamento, ma possono anche determinare come i trattamenti farmacologici acuti nel pesce zebra adulto influiscono sul comportamento sociale¹⁵.

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Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del South Dakota.

1. Stabulazione, cura ed esposizione all'etanolo embrionale del pesce zebra

1. Allevare e allevare il pesce zebra come descritto¹⁶.
2. Esposizione all'etanolo
   1. Scegliere lo stadio di sviluppo appropriato in cui condurre l'esposizione all'etanolo. In questo protocollo gli embrioni sono stati esposti a etanolo a 24 hpf.
   2. Mettere le uova in etanolo all'1,0% in volume/volume per 2 ore^{e 15}. Un rapporto di 1 uovo per mL di EM è una buona pratica. In particolare, posizionare gli embrioni in 50 ml di terreno embrionale (EM; vedere Westerfield¹⁶ per la ricetta EM), quindi rimuovere 500 μL di EM e sostituirli con 500 μL di etanolo.
   3. Dopo l'esposizione all'etanolo, allevare gli embrioni come descritto¹⁷. Analizza il comportamento sociale quando i pesci hanno 16 settimane.

2. Randomizzazione e configurazione del serbatoio

1. Utilizzando un generatore di sequenze casuali online, randomizza tutti gli studi a priori per condurre i saggi comportamentali. Assicurati che il lato dello stimolo e i gruppi di trattamento varino in modo casuale.
2. Per evitare fattori confondenti come l'ora del giorno o il giorno del test, iniziare e terminare il test comportamentale alla stessa ora ogni giorno ed eseguire il test comportamentale in giorni consecutivi fino a quando tutti i pesci sperimentali non sono stati testati.
3. Per questo test (Figura 1), utilizzare un serbatoio da 37 L (50 cm x 25 cm x 30 cm, L x P x A) con serbatoi da 1,4 L posizionati all'esterno lungo la larghezza del serbatoio come descritto in precedenza¹⁷.
4. Rivesti la parte posteriore e il fondo della vasca da 37 L con plastica ondulata bianca per aumentare il contrasto tra i pesci sperimentali e lo sfondo per migliorare il tracciamento video.
5. Posizionare la plastica ondulata sulla parete esterna delle vasche da 1,4 L per aumentare il contrasto dello stimolo sociale per i pesci sperimentali. Infine, posizionare della plastica ondulata bianca tra i serbatoi da 1,4 L e i serbatoi da 37 L; Questa barriera opaca viene utilizzata per impedire ai pesci sperimentali di visualizzare lo stimolo sociale durante l'assuefazione.
6. Posiziona la fotocamera a una distanza sufficiente per catturare l'intera lunghezza della vasca da 37 L più metà delle vasche da 1,4 L e tracciare con precisione i pesci sperimentali adulti.
   NOTA: Vedere quale lato contiene lo stimolo garantisce che i ricercatori abbiano etichettato correttamente le zone di tracciamento e fornisce ridondanza come backup.
7. Se non viene utilizzato l'inseguimento a infrarossi, assicurarsi di illuminare il serbatoio da 37 L. Utilizzare tutte le luci per cappe per acquari disponibili in commercio con una lampada a spettro completo T8 da 15 W.
   NOTA: Se vengono allestite più arene, utilizzare cappe per acquari identiche con lampade identiche.

3. Conduzione del saggio sociale

1. Iniziare riempiendo il serbatoio da 37 L utilizzato per il test comportamentale con acqua identica all'acqua utilizzata nel rack di alloggiamento. Assicurarsi che la temperatura dell'acqua sia compresa tra 2 °C e la cremagliera dell'alloggiamento.
2. A fine giornata svuotare il serbatoio da 37 L. Inizia ogni giornata di test con acqua fresca. Assicurarsi che il livello dell'acqua nel serbatoio da 37 L e il livello dell'acqua nei serbatoi da 1,4 L siano identici. Se la temperatura dell'ambiente non mantiene l'acqua nel serbatoio da 37 L a 28,5 °C 2 °C, sostituire l'acqua con acqua calda a 28,5 °C.
3. Successivamente, imposta le zone di interesse. Consultare il software di tracciamento manuale dell'utente preferito per creare le zone. In questo protocollo, lungo la lunghezza del serbatoio da 37 L in alto e in basso, è stato utilizzato un metro a nastro per segnare incrementi di 5 cm. Dato che la vasca di prova è di 50 cm, incrementi di 5 cm portano a 10 zone di 5 cm ciascuna.
4. Utilizzando come riferimento i segni tracciati sul serbatoio da 37 L, utilizzare il software per costruire le zone collegando il punto di 5 cm in alto al corrispondente punto di 5 cm in basso. Inoltre, crea una zona lungo la parte inferiore e lungo lo stimolo. Personalizza le zone di interesse.
5. Utilizzare il software di tracciamento di questo protocollo per misurare la distanza da una zona e la durata trascorsa nella zona. In questo protocollo sono state utilizzate 12 zone.
6. Quantifica il tempo trascorso nelle zone da 1 a 10 e la distanza dallo stimolo e dal fondo come Zona 1, come la zona più vicina allo stimolo mentre la Zona 10 è la più lontana dallo stimolo.
7. Successivamente, seleziona i due maschi e le due femmine che verranno utilizzati per lo stimolo sociale. La migliore pratica sarebbe quella di utilizzare maschi e femmine della stessa coorte dei pesci sperimentali. Se ciò non è possibile, cerca di trovare pesci che corrispondano al ceppo, all'età e alle dimensioni del pesce sperimentale.
8. Trasferire i pesci sperimentali dalla vasca di stabulazione all'arena di prova (vasca da 37 L). Usa una rete per catturare i pesci nell'acquario di alloggiamento. Metti la rete con il pesce dentro, in un contenitore con acqua di pesce.
   NOTA: L'utilizzo di questo approccio ridurrà lo stress sui pesci sperimentali durante lo spostamento tra le vasche.
9. Posiziona il pesce sperimentale al centro dell'arena di prova.
10. Una volta che le impostazioni di rilevamento sono soddisfacenti in base al software scelto dall'utente (vedere il manuale dell'utente), iniziare la prova di 20 minuti. Durante i primi 10 minuti, lasciare in posizione la barriera opaca tra il serbatoio da 37 L e quello da 1,4 L. Ciò impedirà ai pesci sperimentali di vedere lo stimolo sociale, costituito da due maschi e due femmine di zebrafish, e consentirà ai pesci di acclimatarsi all'arena di test^13,17.
11. Dopo 10 minuti rimuovere con cura le barriere opache tirandole da dietro la vasca; Questo permetterà ai pesci sperimentali di vedere lo stimolo sociale.
12. Utilizzare il software di tracciamento per tracciare e quantificare il comportamento dei pesci sperimentali ^{11, 12, 17} in base alle preferenze dell'utente e al manuale del software. Nel protocollo attuale, quantificare la distanza dallo stimolo sociale e dal fondo della vasca, nonché il tempo trascorso in tutte le zone.
13. Analizza i dati utilizzando gli strumenti di analisi dei dati tradizionali.

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Risultati

La Figura 2 è stata modificata da Fernandes et ^al.17 e mostra che l'esposizione all'etanolo embrionale attenua la risposta di shoaling esaminando la distanza dallo stimolo. I dati in Figura 2 rappresentano la distanza dallo stimolo sociale durante la prova di 20 minuti. L'asse Y mostra la distanza in centimetri mentre l'asse X mostra la prova di 20 minuti suddivisa in intervalli di 1 minuto. La barra ner...

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Discussione

Il pesce zebra ha una serie di caratteristiche biologiche e comportamentali che lo rendono un organismo molto attraente per la ricerca che coinvolge i geni, l'ambiente e il comportamento ^5,19. Questo protocollo fornisce all'utente finale una guida relativamente semplice per valutare il comportamento sociale, diversi modi per quantificare il comportamento sociale e ha il potenziale per collegare le risposte comportamentali dei sin...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.4-l ZT140 Aquaneering tanks	Aquaneering	ZT140	Tanks for social stimulus
Aqueon 20" Deluxe Fluorescent Full Hood aquarium light	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aqueon-aquarium-black-24-fluorescent-deluxe-full-hood-215740		Light for the 37-I tank
Aqueon Standard Open-Glass Glass Aquarium Tank, 10 Gallon	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aga-10g-20x10x12bk-tank-170917		37-l tank for the social assay
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