对斑马鱼的胎儿酒精谱系障碍进行建模，以表征不良胚胎环境对成人社交行为的影响

摘要

当前方案的目标是概述建立和使用成年斑马鱼社会偏好测定的必要步骤，并证明它可用于表征乙醇诱导的社会缺陷。

摘要

胎儿酒精谱系障碍 （FASD） 描述了所有酒精引起的出生缺陷。出生缺陷，如生长缺陷、颅面、行为和认知异常，与 FASD 有关。社交困难是与 FASD 相关的常见行为异常，通常会导致严重的健康问题。动物模型对于理解导致乙醇诱导的社会缺陷的机制至关重要。斑马鱼是群居脊椎动物，会产生外部受精的透明卵;这些特征为研究人员提供了一种精确而简单的程序来创建 FASD 表型和一种先天行为，可用于模拟与 FASD 相关的社交缺陷。 因此，斑马鱼是表征 FASD 社交缺陷的理想选择。当前协议的目标是为用户提供一种简单的行为分析，可用于描述发育早期负面环境的后果及其对成年期社会行为的影响。该方案可用于表征突变或致畸剂对成人社会行为的影响。此处概述的协议演示了如何在 20 分钟的社会分析期间表征个体鱼的社会行为。此外，使用当前方案获得的数据提供了证据，表明该方案可用于表征胚胎乙醇诱导的成年斑马鱼社会缺陷的影响。

引言

产前酒精暴露会导致各种出生缺陷，统称为胎儿酒精谱系障碍 （FASD）¹。行为受损，例如社交困难，是与 FASD 相关的常见出生缺陷 ^2,3。不幸的是，社交困难经常导致严重的心理健康问题⁴，这会对 FASD 患者的生活质量产生不利影响。因此，了解导致乙醇诱导的社会缺陷的机制至关重要。

斑马鱼具有生物学和行为特征，这使得它们非常适合促进我们对导致乙醇诱导的社会缺陷的机制的理解。例如，斑马鱼会产生大量透明的外部受精卵;这些生物学特性使研究人员能够轻松创建精确且可复制的 FASD 表型⁵。要在受精后 24 小时 （hpf） 将胚胎暴露在乙醇中，只需使用解剖显微镜检查透明鸡蛋并根据先前发表的工作（如 Kimmel 等人）6 对胚胎进行分^{期，然后将}鸡蛋置于所需的乙醇浓度中所需的持续时间。由于绒毛膜是酒精的弱屏障⁷，因此乙醇很容易沐浴胚胎。要停止暴露，只需从乙醇溶液中取出鸡蛋即可。除了为研究人员提供一种简单而准确的方法来创建 FASD 表型外，斑马鱼还允许研究人员与人类进行基因比较，因为 70% 的人类基因具有斑马鱼直系同源物，因此它们是了解人类疾病相关基因的宝贵工具⁸。此外，与其他动物模式不同，斑马鱼形成称为浅滩¹⁰ （shoals） 的社会群体⁹ （social groups）。浅滩行为可用于描述胚胎乙醇暴露对社会行为的影响¹¹。此外，在斑马鱼中，可以通过使用计算机控制的社会刺激¹²（computer controlled social stimulis）或活体社会刺激¹³（live social stimulus）来引起社会反应。

以前的工作已经表征了成年斑马鱼在群体中的社会反应¹⁴，但这种方法的一个局限性是无法将个体鱼的行为与特定措施（例如神经递质水平的变化）相关联¹¹。以下协议将使用户能够描述个体成年斑马鱼的社会行为。由于社会行为是针对个体鱼获得的，因此该协议的用户现在可以将每条鱼的获得行为特征与依赖结果相关联。例如，以前的研究表明，胚胎乙醇暴露会损害对社会刺激的多巴胺能反应¹¹。虽然此处显示的数据使用胚胎乙醇暴露作为自变量，但方案用户可以描述其他药物治疗或基因突变对社会行为的影响。此外，方案使用者不仅限于检查胚胎治疗如何改变行为，还可以确定成年斑马鱼的急性药物治疗如何影响社会行为¹⁵。

研究方案

此处描述的所有方法均已获得南达科他大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。

1. 斑马鱼的饲养、护理和胚胎乙醇暴露

1. 按照说明饲养和繁殖斑马鱼¹⁶.
2. 乙醇暴露
   1. 选择合适的发育阶段进行乙醇暴露。在该方案中，胚胎暴露于 24 hpf 的乙醇中。
   2. 将鸡蛋放入 1.0% 乙醇体积/体积中 2 小时¹⁵。每 mL EM 的比例为 1 个鸡蛋是很好的做法。具体来说，将胚胎置于 50 mL 胚胎培养基中（EM;有关 EM 配方，请参见 Westerfield¹⁶ ），然后去除 500 μL EM 并替换为 500 μL 乙醇。
   3. 乙醇暴露后，按说明饲养胚胎¹⁷.检测鱼 16 周龄时的社会行为。

2. 随机化和水箱设置

1. 使用在线随机序列生成器，先 验 地将所有试验随机化以进行行为分析。确保刺激侧和治疗组随机变化。
2. 为避免任何混杂因素，例如一天中的时间或测试日期，每天在同一时间开始和结束行为测试，并连续几天进行行为测试，直到所有实验鱼都通过测试。
3. 对于该测定（图 1），使用 37 L 罐（50 cm x 25 cm x 30 cm，长 x 宽 x 高），如前所述 17 沿罐的宽度放置在外部的^1.4 L 罐。
4. 在 37 L 水箱的背面和底部铺上白色波纹塑料，以增加实验鱼与背景之间的对比度，从而改善视频跟踪。
5. 将波纹塑料放在 1.4 L 水箱的外壁上，以增加实验鱼的社会刺激的对比度。最后，在 1.4 L 气瓶和 37 L 气瓶之间放置白色波纹塑料;这种不透明的屏障用于防止实验鱼在习惯化期间观看社会刺激。
6. 将相机放置在足够远的距离，以捕捉 37 升水箱的整个长度加上 1.4 升水箱的一半，并准确跟踪成年实验鱼。
   注意：查看哪一侧持有刺激可确保研究人员正确标记跟踪区域并提供冗余作为备份。
7. 如果未使用红外跟踪，请确保照亮 37 L 水箱。使用任何市售的水族箱抽油烟机灯和 15 W T8 全光谱灯。
   注意：如果要设置多个场馆，请使用相同的水族箱抽油烟机和相同的灯。

3. 进行社会分析

1. 首先用与外壳架中使用的水相同的水填充用于行为测定的 37 L 水箱。确保水温在外壳机架的 2 °C 以内。
2. 一天结束时，清空 37 L 的气瓶。每天测试开始时，请用淡水。确保 37 L 水箱中的水位与 1.4 L 水箱中的水位相同。如果房间的温度不能将 37 L 水箱中的水保持在 28.5 °C 2 °C，则用 28.5 °C 的温水代替水。
3. 接下来，设置感兴趣的区域。查阅用户选择的手动跟踪软件以创建区域。在该协议中，沿着顶部和底部的 37 L 水箱的长度，使用卷尺标记 5 cm 的增量。假设测试罐为 50 厘米，则 5 厘米的增量会导致 10 个区域，每个区域为 5 厘米。
4. 以 37 L 水箱上的标记为参考，使用软件通过将顶部的 5 cm 点连接到底部相应的 5 cm 点来构建区域。此外，沿着底部和刺激创建一个区域。自定义感兴趣区域。
5. 使用此协议中的跟踪软件测量与区域的距离以及在该区域中花费的持续时间。在该协议中使用了 12 个区域。
6. 量化在 1 到 10 区花费的时间以及与刺激和底部的距离，作为 1 区，作为最靠近刺激的区域，而 10 区距离刺激最远。
7. 接下来，选择将用于社交刺激的两名男性和两名女性。最佳做法是使用与实验鱼来自同一队列的雄性和雌性。如果这是不可能的，请尝试找到与实验鱼的品系、年龄和大小相匹配的鱼。
8. 将实验鱼从饲养箱转移到测试场（37 L 水箱）。使用网捕捉饲养箱中的鱼。将装有鱼的网放入装有鱼水的容器中。
   注意：使用这种方法将减少在水箱之间移动时对实验鱼的压力。
9. 将实验鱼放在测试场的中央。
10. 根据用户选择的软件（参见用户手册）使检测设置令人满意后，开始 20 分钟的试用。在前 10 分钟内，将 37 L 气瓶和 1.4 L 气瓶之间的不透明屏障留在原位。这将阻止实验鱼看到由两只雄性和两只雌性斑马鱼组成的社会刺激，并让鱼适应测试舞台^13,17。
11. 10 分钟后，从水箱后面拉出不透明屏障，小心地去除它们;这将使实验鱼看到社会刺激。
12. 使用跟踪软件根据用户的偏好和软件手册跟踪和量化实验鱼 ^11、12、17 的行为。在当前的协议中，量化与社交刺激和水箱底部的距离以及在所有区域花费的时间。
13. 使用传统的数据分析工具分析数据。

结果

图 2 是从 Fernandes 等人 ¹⁷ 修改而来的，它表明胚胎乙醇暴露通过检查与刺激的距离来减弱浅滩反应。图 2 中的数据表示 20 分钟试验期间与社交刺激的距离。Y 轴显示以厘米为单位的距离，而 X 轴显示 20 分钟的试用，分为 1 分钟的间隔。沿 X 轴的黑条表示不透明障碍已被移除并且测试鱼可以看到社交刺激的时?...

讨论

斑马鱼具有许多生物学和行为特征，使其成为一种极具吸引力的生物体，可用于涉及基因、环境和行为的研究 ^5,19。该协议为最终用户提供了一个相对简单的指南来检测社会行为，多种量化社会行为的方法，并有可能将个体鱼的行为反应与胚胎乙醇暴露、基因突变或其他药理学物质等治疗联系起来。

为了检...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.4-l ZT140 Aquaneering tanks	Aquaneering	ZT140	Tanks for social stimulus
Aqueon 20" Deluxe Fluorescent Full Hood aquarium light	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aqueon-aquarium-black-24-fluorescent-deluxe-full-hood-215740		Light for the 37-I tank
Aqueon Standard Open-Glass Glass Aquarium Tank, 10 Gallon	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aga-10g-20x10x12bk-tank-170917		37-l tank for the social assay
Ethanol	Fisher Scienticfic	BP28184
Ethovision XT tracking system	https://www.noldus.com/ethovision-xt
R-Capable Color Basler GigE Camera	https://www.noldus.com/ethovision-xt
White corrugated plastic	https://www.homedepot.com/p/Coroplast-48-in-x-96-in-x-0-157-in-4mm-White-Corrugated-Twinwall-Plastic-Sheet-CP4896S/205351385		Plastic to line the back and the bottom of the 37-I tank and back of the tanks used for the social stimulus