Modellierung fetaler Alkoholspektrumstörungen beim Zebrafisch, um den Einfluss einer ungünstigen embryonalen Umgebung auf das Sozialverhalten von Erwachsenen zu charakterisieren

Zusammenfassung

Das Ziel des aktuellen Protokolls ist es, die notwendigen Schritte zur Etablierung und Verwendung eines Assays für soziale Präferenzen für adulte Zebrafische zu skizzieren und zu zeigen, dass er zur Charakterisierung von Ethanol-induzierten sozialen Defekten verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Die fetale Alkoholspektrumstörung (FASD) beschreibt alle alkoholbedingten Geburtsfehler. Geburtsfehler wie Wachstumsstörungen, kraniotaktische, Verhaltens- und kognitive Anomalien sind mit FASD verbunden. Soziale Schwierigkeiten sind häufige Verhaltensauffälligkeiten, die mit FASD verbunden sind und oft zu ernsthaften Gesundheitsproblemen führen. Tiermodelle sind entscheidend für das Verständnis der Mechanismen, die für ethanolinduzierte soziale Defekte verantwortlich sind. Zebrafische sind soziale Wirbeltiere, die von außen befruchtete durchsichtige Eier produzieren; Diese Eigenschaften bieten den Forschern ein präzises und dennoch einfaches Verfahren zur Erstellung des FASD-Phänotyps und eines angeborenen Verhaltens, das zur Modellierung der mit FASD verbundenen sozialen Defizite genutzt werden kann. Zebrafische eignen sich daher hervorragend, um die sozialen Defizite der FASD zu charakterisieren. Das Ziel des aktuellen Protokolls ist es, dem Benutzer einen einfachen Verhaltenstest zur Verfügung zu stellen, mit dem die Folgen einer negativen Umgebung in einem frühen Stadium der Entwicklung und die Auswirkungen, die sie auf das Sozialverhalten im Erwachsenenalter haben kann, charakterisiert werden können. Das Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung von Mutationen oder Teratogenen auf das Sozialverhalten von Erwachsenen zu charakterisieren. Das hier skizzierte Protokoll zeigt, wie das Sozialverhalten einzelner Fische während eines 20-minütigen Sozialtests charakterisiert werden kann. Darüber hinaus liefern die mit dem aktuellen Protokoll gewonnenen Daten den Hinweis, dass das Protokoll zur Charakterisierung der Auswirkungen embryonaler Ethanol-induzierter sozialer Defekte bei adulten Zebrafischen verwendet werden kann.

Einleitung

Pränatale Alkoholexposition kann zu einer Vielzahl von Geburtsfehlern führen, die als fetale Alkoholspektrumstörungen (FASD) bekannt ^sind1. Beeinträchtigtes Verhalten, wie z. B. soziale Schwierigkeiten, sind häufige Geburtsfehler im Zusammenhang mit FASD ^2,3. Leider führen soziale Schwierigkeiten häufig zu schwerwiegenden psychischen Problemen⁴, die sich negativ auf die Lebensqualität von Menschen mit FASD auswirken können. Daher ist es von größter Bedeutung, die Mechanismen zu verstehen, die für ethanolinduzierte soziale Defekte verantwortlich sind.

Zebrafische haben biologische und verhaltensbezogene Eigenschaften, die sie gut geeignet machen, unser Verständnis der Mechanismen zu verbessern, die für ethanolinduzierte soziale Defekte verantwortlich sind. Zum Beispiel produzieren Zebrafische große Mengen an transparenten, von außen befruchteten Eiern; Diese biologischen Eigenschaften ermöglichen es den Forschern, auf einfache Weise präzise und replizierbare FASD-Phänotypen zu erstellen⁵. Um Embryonen 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) Ethanol auszusetzen, muss man einfach ein Präpariermikroskop verwenden, um die durchsichtige Eizelle zu untersuchen und den Embryo auf der Grundlage zuvor veröffentlichter Arbeiten wie Kimmel et ^al.6 zu inszenieren, dann die Eizelle für die gewünschte Dauer in die gewünschte Ethanolkonzentration zu bringen. Da das Chorion eine schwache Barriere für Alkohol^{darstellt 7}, badet das Ethanol den Embryo bereitwillig. Um die Exposition zu stoppen, muss man einfach die Eier aus der Ethanollösung nehmen. Zebrafische bieten den Forschern nicht nur eine einfache, aber genaue Methode zur Erstellung von FASD-Phänotypen, sondern ermöglichen es den Forschern auch, genetische Vergleiche mit dem Menschen anzustellen, da 70 % der menschlichen Gene einen Zebrafisch-Ortholog haben, was sie zu einem wertvollen Werkzeug für das Verständnis menschlicher krankheitsbezogener Gene darstellt⁸. Darüber hinaus bilden Zebrafische im Gegensatz zu anderen Tiermodellen soziale Gruppen⁹ , die als Schwärme¹⁰ bezeichnet werden. Das Schwarmverhalten kann verwendet werden, um die Auswirkungen der embryonalen Ethanolexposition auf das Sozialverhalten zu charakterisieren¹¹. Darüber hinaus kann bei Zebrafischen eine soziale Reaktion durch die Verwendung von computergesteuerten sozialen Reizen¹² oder einem lebenden sozialen Reiz¹³ hervorgerufen werden.

Frühere Arbeiten haben die soziale Reaktion adulter Zebrafische in Gruppen^{charakterisiert 14}, eine Einschränkung dieses Ansatzes ist jedoch die Unfähigkeit, das Verhalten eines einzelnen Fisches mit einem bestimmten Maß wie Veränderungen der Neurotransmitterspiegel zu korrelieren¹¹. Das folgende Protokoll gibt den Benutzern die Möglichkeit, das Sozialverhalten eines einzelnen erwachsenen Zebrafisches zu charakterisieren. Da das Sozialverhalten für einzelne Fische erfasst wird, können die Benutzer des Protokolls nun das erworbene Verhaltensprofil jedes Fisches mit einem abhängigen Ergebnis korrelieren. Frühere Arbeiten haben beispielsweise gezeigt, dass die Exposition gegenüber embryonalem Ethanol die dopaminerge Reaktion auf einen sozialen Reiz beeinträchtigt¹¹. Während die hier gezeigten Daten die embryonale Ethanolexposition als unabhängige Variable verwendet haben, können Protokollbenutzer die Auswirkungen anderer pharmakologischer Behandlungen oder genetischer Mutationen auf das Sozialverhalten charakterisieren. Darüber hinaus sind die Benutzer des Protokolls nicht darauf beschränkt, zu untersuchen, wie embryonale Behandlungen das Verhalten verändern, sondern können auch bestimmen, wie akute pharmakologische Behandlungen bei adulten Zebrafischen das Sozialverhalten beeinflussen¹⁵.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of South Dakota genehmigt.

1. Unterbringung, Pflege und embryonale Ethanolexposition von Zebrafischen

1. Aufzucht und Zucht von Zebrafischen wie beschrieben¹⁶.
2. Exposition gegenüber Ethanol
   1. Wählen Sie das geeignete Entwicklungsstadium, in dem die Ethanolexposition durchgeführt werden soll. In diesem Protokoll wurden die Embryonen mit Ethanol bei 24 hpf exponiert.
   2. Eier in 1,0 % Ethanol Volumen/Volumen für 2 h¹⁵ legen. Ein Verhältnis von 1 Ei pro ml EM ist eine gute Praxis. Konkret legen Sie die Embryonen in 50 ml Embryomedium (EM; siehe Westerfield¹⁶ für das EM-Rezept), entfernen Sie dann 500 μl EM und ersetzen Sie es durch 500 μl Ethanol.
   3. Nach der Ethanolexposition die Embryonen wie beschrieben^{aufziehen 17}. Assay des Sozialverhaltens, wenn Fische 16 Wochen alt sind.

2. Randomisierung und Panzeraufbau

1. Mit Hilfe eines Online-Zufallssequenzgenerators randomisieren Sie alle Versuche a priori zur Durchführung der Verhaltensassays. Achten Sie darauf, dass die Stimulusseite und die Behandlungsgruppen zufällig variieren.
2. Um Störfaktoren wie Tageszeit oder Testtag zu vermeiden, starten und beenden Sie den Verhaltenstest jeden Tag zur gleichen Zeit und führen Sie den Verhaltenstest an aufeinanderfolgenden Tagen durch, bis alle Versuchsfische getestet wurden.
3. Für diesen Assay (Abbildung 1) wird ein 37-Liter-Tank (50 cm x 25 cm x 30 cm, L x B x H) mit 1,4-Liter-Tanks verwendet, die entlang der Breite des Tanks nach außen gestellt werden, wie zuvor beschrieben¹⁷.
4. Legen Sie den Rücken und den Boden des 37-Liter-Beckens mit weißer Wellpappe aus, um den Kontrast zwischen dem Versuchsfisch und dem Hintergrund zu erhöhen und so die Videoverfolgung zu verbessern.
5. Legen Sie die Wellpappe auf die Außenwand der 1,4 L Becken, um den Kontrast des sozialen Stimulus für die Versuchsfische zu erhöhen. Legen Sie zum Schluss weißen Wellkunststoff zwischen die 1,4-Liter-Tanks und die 37-Liter-Tanks; Diese undurchsichtige Barriere wird verwendet, um zu verhindern, dass die Versuchsfische den sozialen Reiz während der Gewöhnung sehen.
6. Platzieren Sie die Kamera in einem Abstand, der weit genug ist, um die gesamte Länge des 37-Liter-Tanks plus die Hälfte der 1,4-Liter-Becken zu erfassen und den erwachsenen Versuchsfisch genau zu verfolgen.
   HINWEIS: Wenn Sie sehen, auf welcher Seite der Stimulus gehalten wird, wird sichergestellt, dass die Forscher die Tracking-Zonen korrekt beschriftet haben, und bietet Redundanz als Backup.
7. Wenn keine Infrarot-Nachführung verwendet wird, stellen Sie sicher, dass der 37-Liter-Tank beleuchtet ist. Verwenden Sie alle handelsüblichen Aquarienhaubenleuchten mit einer 15 W T8 Vollspektrumlampe.
   HINWEIS: Wenn mehrere Arenen eingerichtet werden, verwenden Sie identische Aquarienabdeckungen mit identischen Lampen.

3. Durchführung des Social Assays

1. Beginnen Sie damit, den 37-Liter-Tank, der für den Verhaltenstest verwendet wird, mit Wasser zu füllen, das mit dem Wasser identisch ist, das im Gehäusegestell verwendet wird. Stellen Sie sicher, dass die Wassertemperatur innerhalb von 2 °C über dem Gehäusegestell liegt.
2. Am Ende des Tages leeren Sie den 37-Liter-Tank. Beginnen Sie jeden Testtag mit frischem Wasser. Stellen Sie sicher, dass der Wasserstand im 37-Liter-Tank und der Wasserstand in den 1,4-Liter-Tanks identisch sind. Wenn die Raumtemperatur das Wasser im 37-Liter-Tank nicht auf 28,5 °C bis 2 °C hält, ersetzen Sie das Wasser durch warmes Wasser mit 28,5 °C.
3. Richten Sie als Nächstes die Interessenzonen ein. Konsultieren Sie die manuelle Tracking-Software der Wahl des Benutzers, um Zonen zu erstellen. In diesem Protokoll wurde entlang der Länge des 37-Liter-Tanks oben und unten ein Maßband verwendet, um 5-cm-Schritte zu markieren. Da der Prüfbehälter 50 cm breit ist, führen 5-cm-Schritte zu 10 Zonen mit jeweils 5 cm.
4. Verwenden Sie die Markierungen auf dem 37-Liter-Tank als Referenz und verwenden Sie die Software, um die Zonen zu konstruieren, indem Sie den 5-cm-Punkt oben mit dem entsprechenden 5-cm-Punkt unten verbinden. Erstellen Sie zusätzlich eine Zone entlang der Unterseite und entlang des Stimulus. Passen Sie die Interessenzonen an.
5. Verwenden Sie die Tracking-Software in diesem Protokoll, um die Entfernung von einer Zone und die in der Zone verbrachte Dauer zu messen. In diesem Protokoll wurden 12 Zonen verwendet.
6. Quantifizieren Sie die Zeit, die in den Zonen 1 bis 10 verbracht wird, und die Entfernung vom Stimulus und den Boden als Zone 1, als die Zone, die dem Stimulus am nächsten ist, während Zone 10 am weitesten vom Stimulus entfernt ist.
7. Wählen Sie als Nächstes die beiden Männer und zwei Frauen aus, die für den sozialen Stimulus verwendet werden sollen. Am besten verwenden Sie Männchen und Weibchen aus derselben Kohorte wie die Versuchsfische. Wenn dies nicht möglich ist, versuchen Sie, Fische zu finden, die dem Stamm, dem Alter und der Größe der Versuchsfische entsprechen.
8. Setzen Sie die Versuchsfische aus dem Haltungsbecken in die Versuchsarena (37 L Becken) um. Verwenden Sie ein Netz, um den Fisch im Haltungsbecken zu fangen. Legen Sie das Netz mit dem Fisch darin in einen Behälter mit Fischwasser.
   HINWEIS: Die Verwendung dieses Ansatzes reduziert den Stress für Versuchsfische beim Wechsel zwischen den Aquarien.
9. Platzieren Sie den Versuchsfisch in der Mitte der Testarena.
10. Sobald die Erkennungseinstellungen basierend auf der vom Benutzer gewählten Software zufriedenstellend sind (siehe Benutzerhandbuch), beginnen Sie mit der 20-minütigen Testversion. Lassen Sie während der ersten 10 Minuten die undurchsichtige Barriere zwischen dem 37-Liter-Tank und dem 1,4-Liter-Tank an Ort und Stelle. Dadurch wird verhindert, dass die Versuchsfische, bestehend aus zwei männlichen und zwei weiblichen Zebrafischen, den sozialen Reiz sehen, und ermöglicht es den Fischen, sich an die Versuchsarena zu gewöhnen^13,17.
11. Entfernen Sie nach 10 Minuten vorsichtig die undurchsichtigen Barrieren, indem Sie sie hinter dem Tank hervorziehen. So können die Versuchsfische den sozialen Reiz sehen.
12. Verwenden Sie eine Tracking-Software, um das Verhalten der Versuchsfische ^{11, 12, 17} auf der Grundlage der Präferenzen des Benutzers und des Softwarehandbuchs zu verfolgen und zu quantifizieren. Quantifizieren Sie im aktuellen Protokoll die Entfernung vom sozialen Reiz und dem Boden des Tanks sowie die Zeit, die Sie in allen Zonen verbracht haben.
13. Analysieren Sie Daten mit herkömmlichen Datenanalysetools.

Ergebnisse

Abbildung 2 wurde von Fernandes et ^al.17 modifiziert und zeigt, dass die embryonale Ethanolexposition die Schwarmreaktion abschwächt, indem sie den Abstand zum Stimulus untersucht. Die Daten in Abbildung 2 stellen den Abstand zum sozialen Stimulus während des 20-minütigen Versuchs dar. Die Y-Achse zeigt die Entfernung in Zentimetern an, während die X-Achse den 20-minütigen Versuch zeigt, der in 1-Min...

Diskussion

Zebrafische haben eine Reihe von biologischen und verhaltensbezogenen Merkmalen, die sie zu einem äußerst attraktiven Organismus für die Erforschung von Genen, Umwelt und Verhalten machen ^5,19. Dieses Protokoll gibt dem Endbenutzer einen relativ einfachen Leitfaden zur Beurteilung des Sozialverhaltens, mehrere Möglichkeiten zur Quantifizierung des Sozialverhaltens und hat das Potenzial, die Verhaltensreaktionen einzelner Fisc...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.4-l ZT140 Aquaneering tanks	Aquaneering	ZT140	Tanks for social stimulus
Aqueon 20" Deluxe Fluorescent Full Hood aquarium light	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aqueon-aquarium-black-24-fluorescent-deluxe-full-hood-215740		Light for the 37-I tank
Aqueon Standard Open-Glass Glass Aquarium Tank, 10 Gallon	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aga-10g-20x10x12bk-tank-170917		37-l tank for the social assay
Ethanol	Fisher Scienticfic	BP28184
Ethovision XT tracking system	https://www.noldus.com/ethovision-xt
R-Capable Color Basler GigE Camera	https://www.noldus.com/ethovision-xt
White corrugated plastic	https://www.homedepot.com/p/Coroplast-48-in-x-96-in-x-0-157-in-4mm-White-Corrugated-Twinwall-Plastic-Sheet-CP4896S/205351385		Plastic to line the back and the bottom of the 37-I tank and back of the tanks used for the social stimulus