ゼブラフィッシュの胎児アルコールスペクトラム障害をモデル化して、不利な胚環境が成体の社会行動に与える影響を特徴付ける

要約

現在のプロトコルの目標は、成魚のゼブラフィッシュの社会的選好アッセイを確立して使用するために必要な手順を概説し、エタノール誘発性の社会的欠陥を特徴付けるために使用できることを実証することです。

要約

胎児性アルコールスペクトラム障害(FASD)は、すべてのアルコール誘発性先天性欠損症を表します。成長障害、頭蓋顔面、行動、認知の異常などの先天性欠損症は、FASDに関連しています。社会的困難は、FASDに関連する一般的な行動異常であり、しばしば深刻な健康問題を引き起こします。動物モデルは、エタノールによる社会的欠陥の原因となるメカニズムを理解するために重要です。ゼブラフィッシュは、外部受精した透明な卵を産む社会性脊椎動物です。これらの特性により、研究者はFASDの表現型を作成するための正確かつ簡単な手順と、FASDに関連する社会的欠陥をモデル化するために活用できる生来の行動を得ることができます。 したがって、ゼブラフィッシュはFASDの社会的欠陥を特徴付けるのに理想的です。現在のプロトコルの目標は、発達の初期にネガティブな環境の結果と、それが成人期の社会的行動に及ぼす影響を特徴付けるために使用できる簡単な行動アッセイをユーザーに提供することです。このプロトコルは、突然変異または催奇形物質が成人の社会的行動に及ぼす影響を特徴付けるために使用できます。ここで概説するプロトコルは、20分間のソーシャルアッセイ中に個々の魚の社会的行動を特徴付ける方法を示しています。さらに、現在のプロトコールを使用して得られたデータは、プロトコールが成体ゼブラフィッシュにおける胚性エタノール誘発性社会的欠陥の影響を特徴付けるために使用できるという証拠を提供します。

概要

出生前のアルコール曝露は、胎児性アルコールスペクトラム障害(FASD^)と総称されるさまざまな先天性欠損症を引き起こす可能性があります1。社会的困難などの行動障害は、FASD ^2,3 に関連する一般的な先天性欠損症です。残念ながら、社会的な困難はしばしば深刻なメンタル^{ヘルスの問題4}を引き起こし、FASD患者の生活の質に悪影響を与える可能性があります。したがって、エタノール誘発性の社会的欠陥の原因となるメカニズムを理解することが最も重要です。

ゼブラフィッシュは生物学的および行動的特性を備えているため、エタノールによる社会的欠陥の原因となるメカニズムの理解を深めるのに適しています。例えば、ゼブラフィッシュは透明な体外受精卵を大量に産みます。これらの生物学的特性により、研究者は正確で複製可能なFASD表現型⁵を簡単に作成できます。受精後24時間(hpf)で胚をエタノールに曝露するには、解剖顕微鏡を使用して透明な卵子を検査し、Kimmelら⁶などの以前に発表された研究に基づいて胚をステージングし、卵子を所望のエタノール濃度で所望の期間置くだけです。絨毛膜^{はアルコールに対する}弱い障壁であるため7、エタノールは胚を容易に浴びます。曝露を止めるには、エタノール溶液から卵を取り除くだけです。ゼブラフィッシュは、FASD表現型を作成するためのシンプルでありながら正確な方法を研究者に提供するだけでなく、ヒト遺伝子の70%がゼブラフィッシュのオルソログを持っているため、研究者がヒトとの遺伝的比較を行うことも可能にし、ヒトの疾患関連遺伝子を理解するための貴重なツール^{となります8。}さらに、他の動物モデルとは異なり、ゼブラフィッシュは浅瀬¹⁰と呼ばれる社会集団⁹を形成する。群れの行動は、胚性エタノール曝露が社会的行動に及ぼす影響を特徴付けるために使用できる¹¹。さらに、ゼブラフィッシュでは、コンピュータ制御の社会刺激¹²または生きた社会刺激¹³を使用することにより、社会的反応を誘発することができる。

これまでの研究は、成魚のゼブラフィッシュの社会的反応をグループ¹⁴で特徴づけてきたが、このアプローチの限界は、個々の魚の行動を神経伝達物質レベルの変化などの特定の尺度と相関させることができないことである¹¹。以下のプロトコルにより、ユーザーは個々の成魚のゼブラフィッシュの社会的行動を特徴づけることができます。社会的行動は個々の魚について獲得されるため、プロトコルのユーザーは、各魚の獲得された行動プロファイルを従属的な結果と関連付けることができるようになりました。例えば、先行研究は、胚性エタノール曝露が社会刺激¹¹に対するドーパミン作動性反応を損なうことを示した。ここに示されているデータは独立変数として胚性エタノール曝露を使用していますが、プロトコルのユーザーは、他の薬理学的治療または遺伝子変異が社会的行動に及ぼす影響を特徴付けることができます。さらに、プロトコールのユーザーは、胚治療が行動をどのように変化させるかを調べるだけでなく、成体のゼブラフィッシュの急性薬理学的治療が社会的行動にどのように影響するかを決定することもできます¹⁵。

プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、サウスダコタ大学の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. ゼブラフィッシュの飼育、飼育、および胚性エタノール曝露

1. ゼブラフィッシュを飼育し、繁殖させる¹⁶.
2. エタノール曝露
   1. エタノール曝露を行う適切な発達段階を選択してください。このプロトコルでは、胚を24hpfでエタノールに曝露した。
   2. 卵を1.0%エタノール容量/容量に2時間^{15時間入れ}ます。EM1 mLあたり1個の卵の比率が良い方法です。具体的には、胚を50mLの胚培地(EM;EMレシピについてはWesterfield¹⁶ を参照)に入れ、500μLのEMを取り出し、500μLのエタノールと交換します。
   3. エタノール曝露後、記載¹⁷のように胚を育てる。魚が生後16週のときの社会的行動を分析します。

2. ランダム化とタンクのセットアップ

1. オンラインランダムシーケンスジェネレータを使用して、すべての試行を行動アッセイの実施に 先験的に ランダム化します。刺激側と治療群がランダムに異なることを確認してください。
2. 時間帯や試験日などの交絡因子を避けるために、行動アッセイを毎日同時に開始および終了し、すべての実験魚が試験されるまで連続して行動試験を実施します。
3. このアッセイ(図1)では、37Lタンク(50cm x 25cm x 30cm、L x W x H)を使用し、1.4Lタンクを前述の¹⁷と同様にタンクの幅に沿って外側に配置する。
4. 37 Lタンクの背面と底部を白い波形のプラスチックで裏打ちして、実験的な魚と背景の間のコントラストを高め、ビデオトラッキングを改善します。
5. 1.4L水槽の外壁に波形プラスチックを配置して、実験魚の社会的刺激のコントラストを高めます。最後に、1.4 Lタンクと37 Lタンクの間に白い波形プラスチックを配置します。この不透明なバリアは、実験魚が慣れるときに社会的刺激を見るのを防ぐために使用されます。
6. 37 Lタンクと1.4 Lタンクの半分の全長をキャプチャするのに十分な距離にカメラを配置し、成魚の実験魚を正確に追跡します。
   注:どちら側が刺激を保持しているかを確認することで、研究者がトラッキングゾーンに正しくラベルを付け、バックアップとして冗長性を確保できます。
7. 赤外線トラッキングが使用されていない場合は、37Lタンクを照らしてください。市販の水族館用フードライトは、15 W T8フルスペクトルランプと一緒に使用してください。
   注意: 複数のアリーナが設置されている場合は、同じ水槽のフードと同一のランプを使用してください。

3. ソーシャルアッセイの実施

1. まず、ビヘイビアアッセイに使用した37Lタンクに、ハウジングラックに使用した水と同じ水を入れます。水温がハウジングラックから2°C以内であることを確認してください。
2. 一日の終わりに37Lタンクを空にします。各テスト日は新鮮な水で始めてください。37 Lタンクの水位と1.4 Lタンクの水位が同じであることを確認してください。部屋の温度で37Lタンクの水が28.5°C2°Cに保たれない場合は、28.5°Cの温水と交換してください。
3. 次に、対象ゾーンを設定します。ゾーンを作成するには、選択したユーザーズマニュアル追跡ソフトウェアを参照してください。このプロトコルでは、上部と下部の37 Lタンクの長さに沿って、巻尺を使用して5 cm刻みをマークしました。試験タンクが50cmの場合、5cm刻みで10個のゾーンがそれぞれ5cmになります。
4. 37 Lタンクに付けられたマークを参考にして、ソフトウェアを使用して、上部の5 cmポイントを下部の対応する5 cmポイントに接続することにより、ゾーンを構築します。さらに、底面と刺激に沿ってゾーンを作成します。関心のあるゾーンをカスタマイズします。
5. このプロトコルのトラッキングソフトウェアを使用して、ゾーンからの距離とゾーンで費やされた時間を測定します。このプロトコルでは、12のゾーンが使用されました。
6. ゾーン1から10で費やした時間と、刺激からの距離と下部までの距離をゾーン1として定量化し、刺激に最も近いゾーンとしてゾーン10を刺激から最も遠いゾーンとして定量化します。
7. 次に、ソーシャル刺激に使用するオス2人とメス2人を選択します。ベストプラクティスは、実験魚と同じコホートのオスとメスを使用することです。それが不可能な場合は、実験魚の系統、年齢、サイズに一致する魚を探してみてください。
8. 実験魚をハウジングタンクからテストアリーナ(37Lタンク)に移します。ハウジングタンクで魚を捕まえるために網を使用してください。魚が入ったネットを魚の水の入った容器に入れます。
   注:このアプローチを使用すると、水槽間を移動する際の実験魚のストレスが軽減されます。
9. 実験用の魚をテストアリーナの中央に置きます。
10. ユーザーが選択したソフトウェア(ユーザーズマニュアルを参照)に基づいて検出設定が満足のいくものになったら、20分間の試用を開始します。最初の10分間は、37 Lタンクと1.4 Lタンクの間の不透明なバリアをそのままにしておきます。これにより、実験魚は、2匹の雄ゼブラフィッシュと2匹の雌ゼブラフィッシュからなる社会的刺激を見ることができず、魚が試験場^13,17に順応することを可能にする。
11. 10分後、タンクの後ろから不透明なバリアを引っ張って慎重に取り除きます。これにより、実験魚は社会的な刺激を見ることができます。
12. 追跡ソフトウェアを使用して、ユーザーの好みとソフトウェアマニュアルに基づいて、実験魚^11、12、17の行動を追跡および定量化します。現在のプロトコルでは、社会的刺激とタンクの底からの距離、およびすべてのゾーンで費やされた時間を定量化します。
13. 従来のデータ分析ツールを使用してデータを分析します。

結果

図2は、Fernandesら¹⁷から修正されたもので、胚性エタノール曝露が刺激からの距離を調べることにより、浅瀬の反応を鈍らせることを示しています。図2のデータは、20分間の試行中の社会的刺激からの距離を表しています。Y軸はセンチメートル単位の距離を示し、X軸は20分間の試行を1分間隔で示していま?...

ディスカッション

ゼブラフィッシュは、遺伝子、環境、行動に関わる研究において非常に魅力的な生物であり、多くの生物学的および行動的特徴を持っています^5,19。このプロトコルは、エンドユーザーに社会的行動をアッセイするための比較的簡単なガイド、社会的行動を量る複数の方法を提供し、個々の魚の行動応答を胚性エタノール曝...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.4-l ZT140 Aquaneering tanks	Aquaneering	ZT140	Tanks for social stimulus
Aqueon 20" Deluxe Fluorescent Full Hood aquarium light	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aqueon-aquarium-black-24-fluorescent-deluxe-full-hood-215740		Light for the 37-I tank
Aqueon Standard Open-Glass Glass Aquarium Tank, 10 Gallon	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aga-10g-20x10x12bk-tank-170917		37-l tank for the social assay
Ethanol	Fisher Scienticfic	BP28184
Ethovision XT tracking system	https://www.noldus.com/ethovision-xt
R-Capable Color Basler GigE Camera	https://www.noldus.com/ethovision-xt
White corrugated plastic	https://www.homedepot.com/p/Coroplast-48-in-x-96-in-x-0-157-in-4mm-White-Corrugated-Twinwall-Plastic-Sheet-CP4896S/205351385		Plastic to line the back and the bottom of the 37-I tank and back of the tanks used for the social stimulus