توصيل تحت الشبكية لأسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في الفئران RD10

Summary

وصفنا بروتوكولا مفصلا لإعداد الخلايا السلفية للمستقبلات الضوئية المشتقة من hESC المحفوظة بعد التبريد والتوصيل تحت الشبكية لهذه الخلايا في الفئران rd10 .

Abstract

يعد تجديد الخلايا المستقبلة للضوء باستخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات علاجا واعدا لعلاج أمراض الشبكية الوراثية والشيخوخة في المراحل المتقدمة. لقد أظهرنا أن مصفوفة اللامينين المتساوية الشكل الخاصة بشبكية العين البشرية قادرة على دعم تمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) إلى أسلاف المستقبلات الضوئية. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر الحقن تحت الشبكية لهذه الخلايا أيضا استعادة جزئية في نماذج القوارض والأرانب rd10 . من المعروف أن الحقن تحت الشبكية هو طريقة راسخة تم استخدامها لتوصيل المركبات الصيدلانية إلى الخلايا المستقبلة للضوء والطبقة الظهارية المصطبغة بالشبكية (RPE) للعين نظرا لقربها من المساحة المستهدفة. كما تم استخدامه لتوصيل النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي إلى الفضاء تحت الشبكية لعلاج أمراض الشبكية. يمثل التوصيل تحت الشبكية للمركبات والخلايا الصيدلانية في نموذج الفئران تحديا بسبب القيود في حجم مقلة عين الفئران. يصف هذا البروتوكول الإجراء التفصيلي لإعداد الخلايا السلفية للمستقبلات الضوئية المشتقة من hESC للحقن وتقنية التوصيل تحت الشبكية لهذه الخلايا في الفئران الطافرة لالتهاب الشبكية الصباغي الوراثي ، rd10 . يسمح هذا النهج بالعلاج الخلوي للمنطقة المستهدفة ، ولا سيما الطبقة النووية الخارجية لشبكية العين ، حيث تحدث الأمراض التي تؤدي إلى تنكس المستقبلات الضوئية.

Introduction

تؤدي أمراض الشبكية الوراثية والتنكس البقعي المرتبط بالعمر إلى فقدان الخلايا المستقبلة للضوء والعمى في نهاية المطاف. المستقبل الضوئي للشبكية هو طبقة الجزء الخارجي من شبكية العين التي تتكون من خلايا متخصصة مسؤولة عن النقل الضوئي (أي تحويل الضوء إلى إشارات عصبية). توجد خلايا مستقبلات الضوء المخروطية والمخروطية بجوار الطبقة المصطبغة في شبكية العين (RPE)¹. كان العلاج باستبدال الخلايا المستقبلة للضوء لتعويض فقدان الخلايا نهجا علاجيا ناشئا ومتطورا. تم استخدام الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)^2،3،4 ، والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) المشتقة من RP....

Protocol

تم إجراء التجارب في الجسم الحي وفقا للمبادئ التوجيهية والبروتوكول المعتمد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في SingHealth (IACUC) وبيان جمعية الأبحاث في الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية. تم تثبيط مناعة الجراء من P17 (قبل الزرع) إلى P30 (بعد الزرع) عن طريق إطعامهم مياه الشرب التي تحتوي على السيكلوسبورين (260 جم / لتر).

1. تحضير أسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من hESC في اليوم 32 بعد الحفظ بالتبريد

1. وسط تمايز المستقبلات الضوئية قبل التسخين (PRDM) في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
2. استرجع كريوفيال يحتوي على اليوم 32 خلية سلف مستقبلات ضوئية مشتقة من hESC من النيتروجين ....

النتائج

تم تجميع المحقنة الزجاجية سعة 10 ميكرولتر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (الشكل 1) ، وتظهر الإبرة الحادة المستخدمة لتوصيل تعليق / وسائط الخلية في الشكل 1 ب. يوضح الشكل 2 طرقا مختلفة للحقن تحت الشبكية. نصف نهج pars plana في هذا البروتوكول (ا?.......

Discussion

تم استخدام الحقن تحت الشبكية لزراعة تعليق الخلايا لعلاج RPE وأمراض الشبكية^{23،25،26،27،28،31،40}. هذا النهج ضروري للغاية في دراسات القوارض ليس فقط لزرع الخلايا ونهج العل.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3% Tobramycin	Novartis	NDC  0078-0813-01	Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone	Novartis	NDC 0078-0876-01	Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0016-15	0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringe	Turemo	SS01T2713
1% Tropicamide	Alcon	NDC 0998-0355-15	1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0342-05	2.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plate	Costar	3526
30 G Disposable needle	Becton Dickinson (BD)	305128
33 G, 20 mm length blunt needles	Hamilton	7803-05
Automated Cell Counter	NanoEnTek	Model: Eve
B27 without Vitamin A	Life Technologies	12587001	2%36
Buprenorphine	Ceva		Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7	Sigma	C0742	5 µM36
Cyclosporine	Novartis		260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells	DUKE-NUS Medical School		Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
Gauze	Winner Industries Co. Ltd.	1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential Medium	Gibco	11710–035
hESC cell line H1	WiCell Research Institute	WA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02-50	10 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Prospec-Tany Technogene	CYT-272	10 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)	Ceva Santé Animale	KETALAB03
LN-521	Biolamina	LN521-02	1 µg36
mFreSR	STEMCELL Technologies	5854
Microlitre glass syringe (10 mL)	Hamilton	7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)	Selleckchem	S2215	10 µM36
N-2 supplement	Life Technologies	A13707-01	1%36
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140–050	1x36
NutriStem XF Media	Satorius	05-100-1A
Operating microscope	Zeiss	OPMI LUMERA 700	With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)	DUKE-NUS Medical School		See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
Pyruvate	Gibco	11360–070	1 mM36
Rd10 mice	Jackson Laboratory	B6.CXB1-Pde6brd10/J mice	Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g
Retinoic acid	Tocris Bioscience	0695/50	0.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)	Fisher Scientific	12-545-80
SB431542	Sigma	S4317	0.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)	Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)	Troy Laboratories	LI0605
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985–023	0.1 mM36