A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
وصفنا بروتوكولا مفصلا لإعداد الخلايا السلفية للمستقبلات الضوئية المشتقة من hESC المحفوظة بعد التبريد والتوصيل تحت الشبكية لهذه الخلايا في الفئران rd10 .
يعد تجديد الخلايا المستقبلة للضوء باستخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات علاجا واعدا لعلاج أمراض الشبكية الوراثية والشيخوخة في المراحل المتقدمة. لقد أظهرنا أن مصفوفة اللامينين المتساوية الشكل الخاصة بشبكية العين البشرية قادرة على دعم تمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) إلى أسلاف المستقبلات الضوئية. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر الحقن تحت الشبكية لهذه الخلايا أيضا استعادة جزئية في نماذج القوارض والأرانب rd10 . من المعروف أن الحقن تحت الشبكية هو طريقة راسخة تم استخدامها لتوصيل المركبات الصيدلانية إلى الخلايا المستقبلة للضوء والطبقة الظهارية المصطبغة بالشبكية (RPE) للعين نظرا لقربها من المساحة المستهدفة. كما تم استخدامه لتوصيل النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي إلى الفضاء تحت الشبكية لعلاج أمراض الشبكية. يمثل التوصيل تحت الشبكية للمركبات والخلايا الصيدلانية في نموذج الفئران تحديا بسبب القيود في حجم مقلة عين الفئران. يصف هذا البروتوكول الإجراء التفصيلي لإعداد الخلايا السلفية للمستقبلات الضوئية المشتقة من hESC للحقن وتقنية التوصيل تحت الشبكية لهذه الخلايا في الفئران الطافرة لالتهاب الشبكية الصباغي الوراثي ، rd10 . يسمح هذا النهج بالعلاج الخلوي للمنطقة المستهدفة ، ولا سيما الطبقة النووية الخارجية لشبكية العين ، حيث تحدث الأمراض التي تؤدي إلى تنكس المستقبلات الضوئية.
تؤدي أمراض الشبكية الوراثية والتنكس البقعي المرتبط بالعمر إلى فقدان الخلايا المستقبلة للضوء والعمى في نهاية المطاف. المستقبل الضوئي للشبكية هو طبقة الجزء الخارجي من شبكية العين التي تتكون من خلايا متخصصة مسؤولة عن النقل الضوئي (أي تحويل الضوء إلى إشارات عصبية). توجد خلايا مستقبلات الضوء المخروطية والمخروطية بجوار الطبقة المصطبغة في شبكية العين (RPE)1. كان العلاج باستبدال الخلايا المستقبلة للضوء لتعويض فقدان الخلايا نهجا علاجيا ناشئا ومتطورا. تم استخدام الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)2،3،4 ، والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) المشتقة من RP....
تم إجراء التجارب في الجسم الحي وفقا للمبادئ التوجيهية والبروتوكول المعتمد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في SingHealth (IACUC) وبيان جمعية الأبحاث في الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية. تم تثبيط مناعة الجراء من P17 (قبل الزرع) إلى P30 (بعد الزرع) عن طريق إطعامهم مياه الشرب التي تحتوي على السيكلوسبورين (260 جم / لتر).
1. تحضير أسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من hESC في اليوم 32 بعد الحفظ بالتبريد
تم تجميع المحقنة الزجاجية سعة 10 ميكرولتر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (الشكل 1) ، وتظهر الإبرة الحادة المستخدمة لتوصيل تعليق / وسائط الخلية في الشكل 1 ب. يوضح الشكل 2 طرقا مختلفة للحقن تحت الشبكية. نصف نهج pars plana في هذا البروتوكول (ا?.......
تم استخدام الحقن تحت الشبكية لزراعة تعليق الخلايا لعلاج RPE وأمراض الشبكية23،25،26،27،28،31،40. هذا النهج ضروري للغاية في دراسات القوارض ليس فقط لزرع الخلايا ونهج العل.......
هوي غون تاي هو أحد مؤسسي شركة Alder Therapeutics AB. يعلن مؤلفون آخرون عدم وجود مصالح متنافسة.
نشكر وي شنغ تان ولوان شيانغ شيويه ين وشيني لي وينغينغ تشونغ على تقديم المساعدة الفنية لإعداد اليوم 32 من أسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من hESC بعد الحفظ بالتبريد. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من جائزة منحة أبحاث الباحثين الشباب التابعة للمجلس الوطني للبحوث الطبية (NMRC / OFYIRG / 0042/2017) ومنحة برنامج البحث التنافسي الرابع والعشرين لمؤسسة البحوث الوطنية (CRP24-2020-0083) إلى H.G.T.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved