A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وصفنا بروتوكولا مفصلا لإعداد الخلايا السلفية للمستقبلات الضوئية المشتقة من hESC المحفوظة بعد التبريد والتوصيل تحت الشبكية لهذه الخلايا في الفئران rd10 .

Abstract

يعد تجديد الخلايا المستقبلة للضوء باستخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات علاجا واعدا لعلاج أمراض الشبكية الوراثية والشيخوخة في المراحل المتقدمة. لقد أظهرنا أن مصفوفة اللامينين المتساوية الشكل الخاصة بشبكية العين البشرية قادرة على دعم تمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) إلى أسلاف المستقبلات الضوئية. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر الحقن تحت الشبكية لهذه الخلايا أيضا استعادة جزئية في نماذج القوارض والأرانب rd10 . من المعروف أن الحقن تحت الشبكية هو طريقة راسخة تم استخدامها لتوصيل المركبات الصيدلانية إلى الخلايا المستقبلة للضوء والطبقة الظهارية المصطبغة بالشبكية (RPE) للعين نظرا لقربها من المساحة المستهدفة. كما تم استخدامه لتوصيل النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي إلى الفضاء تحت الشبكية لعلاج أمراض الشبكية. يمثل التوصيل تحت الشبكية للمركبات والخلايا الصيدلانية في نموذج الفئران تحديا بسبب القيود في حجم مقلة عين الفئران. يصف هذا البروتوكول الإجراء التفصيلي لإعداد الخلايا السلفية للمستقبلات الضوئية المشتقة من hESC للحقن وتقنية التوصيل تحت الشبكية لهذه الخلايا في الفئران الطافرة لالتهاب الشبكية الصباغي الوراثي ، rd10 . يسمح هذا النهج بالعلاج الخلوي للمنطقة المستهدفة ، ولا سيما الطبقة النووية الخارجية لشبكية العين ، حيث تحدث الأمراض التي تؤدي إلى تنكس المستقبلات الضوئية.

Introduction

تؤدي أمراض الشبكية الوراثية والتنكس البقعي المرتبط بالعمر إلى فقدان الخلايا المستقبلة للضوء والعمى في نهاية المطاف. المستقبل الضوئي للشبكية هو طبقة الجزء الخارجي من شبكية العين التي تتكون من خلايا متخصصة مسؤولة عن النقل الضوئي (أي تحويل الضوء إلى إشارات عصبية). توجد خلايا مستقبلات الضوء المخروطية والمخروطية بجوار الطبقة المصطبغة في شبكية العين (RPE)1. كان العلاج باستبدال الخلايا المستقبلة للضوء لتعويض فقدان الخلايا نهجا علاجيا ناشئا ومتطورا. تم استخدام الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)2،3،4 ، والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) المشتقة من RP....

Protocol

تم إجراء التجارب في الجسم الحي وفقا للمبادئ التوجيهية والبروتوكول المعتمد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في SingHealth (IACUC) وبيان جمعية الأبحاث في الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية. تم تثبيط مناعة الجراء من P17 (قبل الزرع) إلى P30 (بعد الزرع) عن طريق إطعامهم مياه الشرب التي تحتوي على السيكلوسبورين (260 جم / لتر).

1. تحضير أسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من hESC في اليوم 32 بعد الحفظ بالتبريد

  1. وسط تمايز المستقبلات الضوئية قبل التسخين (PRDM) في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
  2. استرجع كريوفيال يحتوي على اليوم 32 خلية سلف مستقبلات ضوئية مشتقة من hESC من النيتروجين ....

النتائج

تم تجميع المحقنة الزجاجية سعة 10 ميكرولتر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (الشكل 1) ، وتظهر الإبرة الحادة المستخدمة لتوصيل تعليق / وسائط الخلية في الشكل 1 ب. يوضح الشكل 2 طرقا مختلفة للحقن تحت الشبكية. نصف نهج pars plana في هذا البروتوكول (ا?.......

Discussion

تم استخدام الحقن تحت الشبكية لزراعة تعليق الخلايا لعلاج RPE وأمراض الشبكية23،25،26،27،28،31،40. هذا النهج ضروري للغاية في دراسات القوارض ليس فقط لزرع الخلايا ونهج العل.......

Disclosures

هوي غون تاي هو أحد مؤسسي شركة Alder Therapeutics AB. يعلن مؤلفون آخرون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

نشكر وي شنغ تان ولوان شيانغ شيويه ين وشيني لي وينغينغ تشونغ على تقديم المساعدة الفنية لإعداد اليوم 32 من أسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من hESC بعد الحفظ بالتبريد. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من جائزة منحة أبحاث الباحثين الشباب التابعة للمجلس الوطني للبحوث الطبية (NMRC / OFYIRG / 0042/2017) ومنحة برنامج البحث التنافسي الرابع والعشرين لمؤسسة البحوث الوطنية (CRP24-2020-0083) إلى H.G.T.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.3% TobramycinNovartisNDC  0078-0813-01Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% DexamethasoneNovartisNDC 0078-0876-01Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochlorideAlconNDC 0998-0016-150.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringeTuremoSS01T2713
1% TropicamideAlconNDC 0998-0355-151% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochlorideAlconNDC 0998-0342-052.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plateCostar3526
30 G Disposable needleBecton Dickinson (BD)305128
33 G, 20 mm length blunt needlesHamilton7803-05
Automated Cell CounterNanoEnTekModel: Eve
B27 without Vitamin ALife Technologies125870012%36
BuprenorphineCevaVetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7SigmaC07425 µM36
CyclosporineNovartis260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cellsDUKE-NUS Medical SchoolHuman embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
GauzeWinner Industries Co. Ltd.1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential MediumGibco11710–035
hESC cell line H1WiCell Research InstituteWA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)Peprotech450-02-5010 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)Prospec-Tany TechnogeneCYT-27210 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)Ceva Santé AnimaleKETALAB03
LN-521BiolaminaLN521-021 µg36
mFreSRSTEMCELL Technologies5854
Microlitre glass syringe (10 mL)Hamilton7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)SelleckchemS221510 µM36
N-2 supplementLife TechnologiesA13707-011%36
Non-essential amino acids (NEAA)Gibco11140–0501x36
NutriStem XF MediaSatorius05-100-1A
Operating microscopeZeissOPMI LUMERA 700With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)DUKE-NUS Medical SchoolSee media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
PyruvateGibco11360–0701 mM36
Rd10 miceJackson LaboratoryB6.CXB1-Pde6brd10/J miceGender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g 
Retinoic acidTocris Bioscience0695/500.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)Fisher Scientific12-545-80
SB431542SigmaS43170.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)Troy LaboratoriesLI0605
β-mercaptoethanolLife Technologies21985–0230.1 mM36

References

  1. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  2. Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Laminin Isoform Rd10 RPE Gene

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved