JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Описан подробный протокол подготовки посткриоконсервированных клеток-предшественников фоторецепторов hESC и субретинальной доставки этих клеток у мышей rd10 .

Аннотация

Регенерация фоторецепторных клеток с помощью плюрипотентных стволовых клеток человека является перспективной терапией для лечения как наследственных, так и возрастных заболеваний сетчатки на поздних стадиях. Мы показали, что человеческий рекомбинантный матрица изоформы ламинина, специфичная для сетчатки, способна поддерживать дифференцировку эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) в прогениторы фоторецепторов. Кроме того, субретинальная инъекция этих клеток также показала частичное восстановление на моделях грызунов и кроликов rd10 . Субретинальная инъекция, как известно, является признанным методом, который используется для доставки фармацевтических соединений в фоторецепторные клетки и слой пигментного эпителия сетчатки (RPE) глаза из-за его близости к целевому пространству. Он также используется для доставки аденоассоциированных вирусных векторов в субретинальное пространство для лечения заболеваний сетчатки. Субретинальная доставка фармацевтических соединений и клеток в мышиной модели затруднена из-за ограничений в размере мышиного глазного яблока. В этом протоколе подробно описана процедура подготовки клеток-предшественников фоторецепторов, полученных из hESC, для инъекции и методика субретинальной доставки этих клеток у мышей с мутацией генетического пигментного ретинита, rd10 . Такой подход позволяет проводить клеточную терапию в целевой области, в частности во внешнем ядерном слое сетчатки, где происходят заболевания, приводящие к дегенерации фоторецепторов.

Введение

Наследственные заболевания сетчатки и возрастная макулярная дегенерация приводят к потере фоторецепторных клеток и, в конечном итоге, к слепоте. Фоторецептор сетчатки представляет собой наружный сегментный слой сетчатки, состоящий из специализированных клеток, ответственных за фототрансдукцию (т.е. преобразование света в нейронные сигналы). Палочковидные и колбочковые фоторецепторные клетки примыкают к пигментному слою сетчатки (РПЭ)1. Заместительная терапия фоторецепторными клетками для компенсации потери клеток является новым и развивающимся терапевтическим подходом. Для восстановления поврежденных фоторецепторных клеток использовали эмбриональные стволовые клетки (ЭСК)2,3,4, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), полученные из РПЭ, и клетки-предшественники сетчатки (РПК)4,5,6,7,8. Субретинальное пространство, ограниченное пространство между сетчаткой и РПЭ, является привлекательным местом для депонирования этих клеток для замены поврежденных фоторецепторных клеток, РПЭ и клеток Мюллера из-за его близости 9,10,11.

Генная и клеточная терапия использует субретинальное пространство для регенеративной медицины при различных заболеваниях сетчатки в доклинических исследованиях. Это включает в себя доставку функциональных копий гена или инструментов редактирования генов в форме антисмысловой олигонуклеотидной терапии12,13 или CRISPR/Cas9 или редактирования оснований с помощью стратегии 14,15,16, основанной на аденоассоциированном вирусе (AAV), имплантацию материалов (например, листа RPE, протезирования сетчатки 17,18,19) и дифференцированных органоидов сетчатки, полученных из стволовых клеток 20,21,22 для лечения заболеваний сетчатки и РПЭ. Клинические исследования с использованием hESC-RPE31 в субретинальном пространстве для лечения врожденного амавроза Лебера, ассоциированного с RPE65 (LCA)23,24, CNGA3-ассоциированной ахроматопсии25, MERTK-ассоциированного пигментного ретинита26, хороидеремии 27,28,29,30 доказали свою эффективность. Прямое введение клеток в окрестности поврежденного участка значительно повышает вероятность заселения клеток в соответствующей области, синаптической интеграции и, в конечном итоге, улучшения зрения.

Несмотря на то, что субретинальная инъекция в моделях человека и большеглазых животных (т.е. свиньи 32,33,34,35, кролика 36,37,38,39,40 и нечеловекообразного примата 41,42,43) была установлена, такая инъекция в мышиной модели все еще является сложной задачей из-за ограниченного размера глазного яблока и огромных размеров линза, занимающая глаз мыши 44,45,46. Тем не менее, генетически модифицированные модели легко доступны только для мелких животных, а не для крупных животных (т.е. кроликов и нечеловекообразных приматов), поэтому субретинальная инъекция мышам привлекает внимание к исследованию новых терапевтических подходов к генетическим заболеваниям сетчатки. Для доставки клеток или AAV в субретинальное пространство используются три основных подхода, а именно трансроговичный путь, транссклеральный путь и pars plana (см. рис. 2). Трансроговичный и транссклеральный пути связаны с образованием катаракты, синехий, хориоидейальных кровотечений и рефлюкса из места инъекции 11,44,45,47,48,49. Мы приняли подход pars plana в качестве прямой визуализации процесса инъекции, и место инъекции может быть достигнуто в режиме реального времени под микроскопом.

Недавно мы описали метод, который может дифференцировать человеческие эмбриональные стволовые клетки (чЭСК) в фоторецепторы-предшественники в ксеносвободных, химически определенных условиях с использованием рекомбинантной изоформы ламинина LN523, специфичной для сетчатки человека. Поскольку было обнаружено, что LN523 присутствует в сетчатке, мы предположили, что ниша внеклеточного матрикса сетчатки человека может быть рекапитулирована in vitro и тем самым поддерживать дифференцировку фоторецепторов от чЭСК36. Одноклеточный транскриптомный анализ показал, что предшественники фоторецепторов, совместно экспрессирующие конусно-палочковый гомеобокс и рекремен, генерировались через 32 дня. Модель мутантной мыши с дегенерацией сетчатки 10 (rd10), которая имитирует пигментный аутосомный ретинит человека, была использована для оценки эффективности фоторецепторов-предшественников in vivo на 32-й день hESC. Клетки-предшественники фоторецепторов, полученные из hESC, были введены в субретинальное пространство мышей rd10 на P20, где продолжается дисфункция и дегенерация фоторецептора36. В данной статье мы опишем подробный протокол подготовки посткриоконсервированных фоторецепторов-предшественников hESC и их доставки в субретинальное пространство мышей rd10 . Этот метод также может быть использован для введения AAV, клеточных суспензий, пептидов или химических веществ в субретинальное пространство у мышей.

протокол

Эксперименты in vivo проводились в соответствии с руководящими принципами и протоколом, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных SingHealth (IACUC) и Заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Иммунная супрессия щенков проводилась с P17 (до трансплантации) до P30 (после трансплантации) путем кормления их питьевой водой, содержащей циклоспорин (260 г/л).

1. Подготовка фоторецепторов-предшественников на 32-й день после криоконсервации

  1. Предварительно нагрейте среду дифференцировки фоторецепторов (PRDM) на водяной бане с температурой 37 °C.
  2. Извлеките из жидкого азота криовиал, содержащий клетки-предшественники фоторецепторов на 32-й день чЭСК. Хранить на сухом льду.
  3. Криовиал разморозить при 37 °C на водяной бане в течение 3-5 мин. Ресуспендировать в течение дня 32 клетки в 1 мл PRDM и центрифугировать при 130 х г в течение 4 мин.
  4. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл PRDM.
  5. Удалите 10 мкл смеси для подсчета клеток. Смешайте ячейки, используя 0,2% трипанового синего в соответствии с инструкциями производителя. Смешение ячеек пипетки в предметное стекло счетной камеры. Определите количество и жизнеспособность клеток с помощью автоматического счетчика клеток.
  6. Переходите к следующему шагу, когда жизнеспособность клетки превысит 70%. Центрифугируйте оставшуюся клеточную суспензию при 130 x g в течение 4 мин. Удалить надосадочную жидкость и повторно суспендировать клеточную гранулу в PRDM в концентрации 3 x 105 клеток/мкл для трансплантации.
  7. Понаблюдайте за видимыми скоплениями клеток. Ресуспендируйте клеточные сгустки несколько раз с помощью наконечника пипетки объемом 10 мкл в пробирке микрофуги до тех пор, пока не исчезнет видимый клеточный комок. Загрузите в шприц для инъекций 33G для наблюдения за экструзией клеточного раствора через иглу.

2. Субретинальная доставка чЭСК у мышей rd10

  1. Подготовка животных
    1. Обезболивайте мышь (P20, самец/самка, 3-6 г) с помощью комбинации кетамина (20 мг/кг массы тела) и ксилазина (2 мг/кг массы тела) в туберкулиновом шприце объемом 1 мл, прикрепленном к игле 27G, внутрибрюшинным доступом. Введите мышам подкожную инъекцию бупренорфина (0,05 мг/кг) в качестве упреждающего анальгетика.
    2. После введения анестезии закапывают по капле 1% тропикамида и 2,5% фенилэфрина для расширения зрачка. Нанесите офтальмологический гель на роговицу, чтобы предотвратить сухость глаз и катаракту, связанную с анестезией.
    3. Поместите мышь в пустую клетку до полного обезболивания. Оцените надлежащий уровень анестетика, ущипнув подушечку лапы, и убедитесь, что животное не реагирует на сильное щипку.
    4. Когда мышь будет полностью обезболина, положите животное на теплую подушку, установленную при температуре 38 °C.
  2. Субретинальная доставка клеток
    1. Чтобы использовать 1-портовый трансвитреальный подход pars plana, как это сделано здесь, выполните субретинальную инъекцию в стерильной среде. Для выполнения инъекции используйте вертикальный операционный микроскоп с прямым световым трактом.
    2. Подготовьте стеклянный шприц объемом 10 мкл, сняв ступицу иглы. Установите тупую иглу 33G на стеклянный шприц. Возьмите металлическую крышку ступицы и аккуратно закрепите иглу на шприце.
    3. Промойте дистиллированной водой, чтобы проверить наличие признаков утечки и проходимости иглы. Опорожните шприц и осторожно положите его в сторону.
    4. Положите мышь под наркозом на подушку так, чтобы лечебный глаз смотрел прямо на объектив микроскопа. Нанесите 0,5% пропаракаина гидрохлорид и подождите 30 с. Нанесите 150 мкл офтальмологического геля на глаз и наложите на него круглый покровный листок.
    5. Выполните грубое обследование глаза, осматривая роговицу, радужную оболочку, зрачок, хрусталик и конъюнктиву. Через зрачок визуализируйте глазное дно мышиного глаза, регулируя фокальную плоскость. Отрегулируйте голову до тех пор, пока оптическая головка не окажется в центре зрачка, и минимизируйте движение головы, правильно расположив ее на подушке.
    6. Осторожно постучите по дну пробирки с чЭСК несколько раз, чтобы получить однородную клеточную суспензию. Используя стеклянный микролитровый шприц объемом 10 мкл с тупой иглой 33G, извлеките 2 мкл клеток/среды. Извлеките клетки непосредственно перед инъекцией, чтобы избежать осаждения/слипания клеток в шприце.
    7. С помощью одноразовой иглы 30G сделайте склерэктомическую рану на 2 мм позади лимба. Держите угол иглы ~45°, чтобы не касаться объектива. Как только кончик иглы визуализируется в глазу, осторожно извлеките иглу. Выбросьте иглу в контейнер для острых предметов после использования, чтобы избежать укола иглой.
    8. Возьмите стеклянный шприц и введите тупую иглу в рану после склерэктомии. Не прикасаясь к хрусталику, продвигайте тупую иглу до тех пор, пока она не достигнет сетчатки, противоположной входной ране. Убедитесь, что в области инъекции нет крупных кровеносных сосудов сетчатки, чтобы избежать кровотечения.
    9. Осторожно проникните в сетчатку до тех пор, пока не станет видна ответвление на склере. Держите тупой конец иглы параллельно склере, чтобы избежать просачивания клеток в стекловидное тело.
    10. Медленно введите 2 мкл клеточной суспензии или среды PRDM (контроль) в субретинальное пространство, поддерживая мягкое давление на шприц. При успешной инъекции в месте инъекции должен образоваться видимый пузырь (т.е. приподнятая сетчатка с клеточной суспензией/средой в ней).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инъекции следует использовать только мягкое давление, чтобы избежать разрыва сетчатки и закупорки клеток на кончике иглы.
    11. После подтверждения блеба подождите 10 с, чтобы клетки успокоились. Аккуратно втяните иглу из ушка.
  3. Интраоперационная оптическая когерентная томография (ОКТ) (опция)
    1. Расположите глаз мыши, чтобы визуализировать шарик под микроскопом, медленно двигая головой. Зафиксируйте положение, осторожно удерживая голову. Дополнительное расширение зрачка не требуется. Не снимайте покровное покрытие и гель на глаз. Это дает прозрачную оптическую среду для визуализации пузыря.
    2. Выполняйте интраоперационную ОКТ с помощью встроенной функции iOCT операционного микроскопа.
    3. Нажмите кнопку Cube (Куб ) на экране OCT и расположите область сканирования на шарике, нажимая кнопки со стрелками . Отрегулируйте OCT, переместив центрирование и фокусировку для достижения наилучшего качества OCT. Нажмите Capture/Scan , чтобы получить ОКТ-скан области bleb. Просмотрите изображения, чтобы проверить качество сканов.
  4. Выздоровление
    1. Снимите покровный листок и очистите глаз гелем с помощью марли. Нанесите мазь с антибиотиком один раз после инъекции, чтобы предотвратить инфицирование.
    2. Дайте животному прийти в себя после анестезии под теплым светом, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания положения грудины и возвращения в домашнюю клетку. Наблюдайте за животным в течение как минимум 3 дней после инъекции на предмет признаков воспаления, инфекции и стресса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теплый свет мощностью 150 Вт должен находиться на расстоянии не менее 30 см от клетки для животных, и следует соблюдать осторожность, чтобы избежать ожогов.
    3. Вводят подкожную инъекцию бупренорфина (0,05 мг/кг) 8 часов в течение 1 дня или по рекомендации ветеринара. Если наблюдается воспаление или инфекция глаза, обратитесь к ветеринарному врачу для соответствующего лечения.
  5. Очистка и стерилизация инструментов
    1. Промойте стеклянный микролитровый шприц объемом 10 мкл и тупую иглу 33G 100% этанолом 10x. Смойте этанол, прошив шприц дистиллированной водой.
    2. Разберите стеклянный шприц и иглу. Высушите шприц для хранения.

Результаты

Стеклянный шприц объемом 10 мкл был собран в соответствии с инструкциями производителя (рис. 1), а тупая игла, используемая для подачи клеточной суспензии/среды, показана на рисунке 1B. Различные подходы к субретинальной инъекции проиллюстрированы на

Обсуждение

Субретинальная инъекция была использована для трансплантации клеточной суспензии для лечения РПЭ и заболеваний сетчатки 23,25,26,27,28,31,40. Этот подход очень важен ...

Раскрытие информации

Хви Гун Тай является соучредителем компании Alder Therapeutics AB. Другие авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы благодарим Вэй Шэн Тана, Луанн Чан, Сюэ Йена, Синьи Ли и Инин Чунг за оказанную техническую помощь в подготовке фоторецепторов-предшественников на 32-й день после криоконсервации. Эта работа была частично поддержана грантами Национального совета по медицинским исследованиям (NMRC/OFYIRG/0042/2017) и грантом24-й конкурсной исследовательской программы Национального исследовательского фонда (CRP24-2020-0083) для H.G.T.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.3% TobramycinNovartisNDC  0078-0813-01Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% DexamethasoneNovartisNDC 0078-0876-01Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochlorideAlconNDC 0998-0016-150.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringeTuremoSS01T2713
1% TropicamideAlconNDC 0998-0355-151% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochlorideAlconNDC 0998-0342-052.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plateCostar3526
30 G Disposable needleBecton Dickinson (BD)305128
33 G, 20 mm length blunt needlesHamilton7803-05
Automated Cell CounterNanoEnTekModel: Eve
B27 without Vitamin ALife Technologies125870012%36
BuprenorphineCevaVetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7SigmaC07425 µM36
CyclosporineNovartis260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cellsDUKE-NUS Medical SchoolHuman embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
GauzeWinner Industries Co. Ltd.1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential MediumGibco11710–035
hESC cell line H1WiCell Research InstituteWA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)Peprotech450-02-5010 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)Prospec-Tany TechnogeneCYT-27210 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)Ceva Santé AnimaleKETALAB03
LN-521BiolaminaLN521-021 µg36
mFreSRSTEMCELL Technologies5854
Microlitre glass syringe (10 mL)Hamilton7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)SelleckchemS221510 µM36
N-2 supplementLife TechnologiesA13707-011%36
Non-essential amino acids (NEAA)Gibco11140–0501x36
NutriStem XF MediaSatorius05-100-1A
Operating microscopeZeissOPMI LUMERA 700With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)DUKE-NUS Medical SchoolSee media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
PyruvateGibco11360–0701 mM36
Rd10 miceJackson LaboratoryB6.CXB1-Pde6brd10/J miceGender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g 
Retinoic acidTocris Bioscience0695/500.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)Fisher Scientific12-545-80
SB431542SigmaS43170.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)Troy LaboratoriesLI0605
β-mercaptoethanolLife Technologies21985–0230.1 mM36

Ссылки

  1. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  2. Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15 (2), 482-497 (2020).
  3. Petrus-Reurer, S., et al. Preclinical safety studies of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells for the treatment of age-related macular degeneration. Stem cells translational medicine. 9 (8), 936-953 (2020).
  4. Wang, S. T., et al. Transplantation of Retinal Progenitor Cells from Optic Cup-Like Structures Differentiated from Human Embryonic Stem Cells In Vitro and In Vivo Generation of Retinal Ganglion-Like Cells. Stem cells and development. 28 (4), 258-267 (2019).
  5. Wang, Z., et al. Intravitreal Injection of Human Retinal Progenitor Cells for Treatment of Retinal Degeneration. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 26, e921184-e921191 (2020).
  6. Semo, M., et al. Efficacy and Safety of Human Retinal Progenitor Cells. Translational vision science & technology. 5 (4), 6 (2016).
  7. Luo, J., et al. Human Retinal Progenitor Cell Transplantation Preserves Vision. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6362 (2014).
  8. Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem cell research & therapy. 8 (1), 209 (2017).
  9. Maia, M., et al. Effects of indocyanine green injection on the retinal surface and into the subretinal space in rabbits. Retina (Philadelphia, Pa). 24 (1), 80-91 (2004).
  10. Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 884, 53 (2012).
  11. Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
  12. Murray, S. F., et al. Allele-Specific Inhibition of Rhodopsin With an Antisense Oligonucleotide Slows Photoreceptor Cell Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6362 (2015).
  13. Cideciyan, A. V., et al. Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8547-E8556 (2018).
  14. Maeder, M. L., et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nature medicine. 25 (2), 229-233 (2019).
  15. Katrekar, D., et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nature methods. 16 (3), 239 (2019).
  16. Ong, T., Pennesi, M. E., Birch, D. G., Lam, B. L., Tsang, S. H. Adeno-Associated Viral Gene Therapy for Inherited Retinal Disease. Pharmaceutical Research. 36 (2), 34 (2019).
  17. Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative ophthalmology & visual science. 46 (2), 674-682 (2005).
  18. Liu, Z., et al. Surgical Transplantation of Human RPE Stem Cell-Derived RPE Monolayers into Non-Human Primates with Immunosuppression. Stem cell reports. 16 (2), 237-251 (2021).
  19. Martinez Camarillo, J. C., et al. Development of a Surgical Technique for Subretinal Implants in Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. (190), e64585 (2022).
  20. Xue, Y., et al. The Prospects for Retinal Organoids in Treatment of Retinal Diseases. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology. 11 (4), 314-327 (2022).
  21. McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
  22. Lin, B., et al. Retina organoid transplants develop photoreceptors and improve visual function in RCS rats with RPE dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (11), 34 (2020).
  23. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet (London, England). 390 (10097), 849-860 (2017).
  24. Testa, F., et al. Three Year Follow-Up after Unilateral Subretinal Delivery of Adeno-Associated Virus in Patients with Leber Congenital Amaurosis Type 2. Ophthalmology. 120 (6), 1283 (2013).
  25. Fischer, M. D., et al. Safety and Vision Outcomes of Subretinal Gene Therapy Targeting Cone Photoreceptors in Achromatopsia: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA ophthalmology. 138 (6), 643-651 (2020).
  26. Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Human genetics. 135 (3), 327-343 (2016).
  27. MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet (London, England). 383 (9923), 1129-1137 (2014).
  28. Lam, B. L., et al. Choroideremia Gene Therapy Phase 2 Clinical Trial: 24-Month Results. American journal of ophthalmology. 197, 65-73 (2019).
  29. Xue, K., et al. Beneficial effects on vision in patients undergoing retinal gene therapy for choroideremia. Nature medicine. 24 (10), 1507-1512 (2018).
  30. Zhai, Y., et al. AAV2-Mediated Gene Therapy for Choroideremia: 5-Year Results and Alternate Anti-sense Oligonucleotide Therapy. American Journal of Ophthalmology. 248, 145-156 (2023).
  31. Schwartz, S. D., Tan, G., Hosseini, H., Nagiel, A. Subretinal Transplantation of Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for the Treatment of Macular Degeneration: An Assessment at 4 Years. Investigative ophthalmology & visual science. 57 (5), ORSFc1-ORSFc9 (2016).
  32. Vu, Q. A., et al. Structural changes in the retina after implantation of subretinal three-dimensional implants in mini pigs. Frontiers in Neuroscience. 16, 1010445 (2022).
  33. Spindler, L., et al. Controlled injection pressure prevents damage during subretinal injections in pigs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5918-5918 (2018).
  34. Yang, K., et al. Robot-assisted subretinal injection system: development and preliminary verification. BMC Ophthalmology. 22 (1), 1-10 (2022).
  35. Olufsen, M. E., et al. Controlled Subretinal Injection Pressure Prevents Damage in Pigs. Ophthalmologica. Journal international d’ophtalmologie. International journal of ophthalmology. Zeitschrift fur Augenheilkunde. 245 (3), 285-293 (2022).
  36. Tay, H. G., et al. Photoreceptor laminin drives differentiation of human pluripotent stem cells to photoreceptor progenitors that partially restore retina function. Molecular therapy the journal of the American Society of Gene Therapy. 31 (3), 825-846 (2023).
  37. Petrus-Reurer, S., et al. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. Journal of visualized experiments: JoVE. (131), e56702 (2018).
  38. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
  39. Babu, V. S., et al. Depleted Hexokinase1 and lack of AMPKα activation favor OXPHOS-dependent energetics in Retinoblastoma tumors. Translational research the journal of laboratory and clinical medicine. (23), 00108-00111 (2023).
  40. Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem cell reports. 6 (1), 9-17 (2016).
  41. Takahashi, K., et al. The influence of subretinal injection pressure on the microstructure of the monkey retina. PLoS ONE. 13 (12), e0209996 (2018).
  42. Tan, G. S. W., et al. Hints for Gentle Submacular Injection in Non-Human Primates Based on Intraoperative OCT Guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10-10 (2021).
  43. Yiu, G., et al. Suprachoroidal and Subretinal Injections of AAV Using Transscleral Microneedles for Retinal Gene Delivery in Nonhuman Primates. Molecular therapy. Methods & clinical development. 16, 179-191 (2020).
  44. Mühlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized Technique for Subretinal Injections in Mice. Methods in Molecular Biology. 935, 343-349 (2012).
  45. Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nature Protocols. 17 (6), 1468-1485 (2022).
  46. Huang, P., et al. The Learning Curve of Murine Subretinal Injection Among Clinically Trained Ophthalmic Surgeons. Translational Vision Science & Technology. 11 (3), 13 (2022).
  47. Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLOS ONE. 10 (8), e0136523 (2015).
  48. Irigoyen, C., et al. Subretinal Injection Techniques for Retinal Disease: A Review. Journal of Clinical Medicine. 11 (16), 4717 (2022).
  49. Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), e54808 (2016).
  50. Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Rd10RPE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены