Livraison sous-rétinienne de progéniteurs de photorécepteurs dérivés de cellules souches embryonnaires humaines chez des souris rd10

Résumé

Nous décrivons un protocole détaillé pour la préparation de cellules progénitrices photoréceptrices dérivées de hESC post-cryopréservées et l’administration sous-rétinienne de ces cellules chez des souris rd10 .

Résumé

La régénération des cellules photoréceptrices à l’aide de cellules souches pluripotentes humaines est une thérapie prometteuse pour le traitement des maladies rétiniennes héréditaires et vieillissantes à des stades avancés. Nous avons montré que la matrice isoforme de laminine recombinante spécifique de la rétine humaine est capable de soutenir la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en progéniteurs de photorécepteurs. De plus, l’injection sous-rétinienne de ces cellules a également montré une restauration partielle dans les modèles de rongeurs et de lapins rd10 . L’injection sous-rétinienne est connue pour être une méthode établie qui a été utilisée pour délivrer des composés pharmaceutiques aux cellules photoréceptrices et à la couche épithéliale pigmentée rétinienne (EPR) de l’œil en raison de sa proximité avec l’espace cible. Il a également été utilisé pour délivrer des vecteurs viraux adéno-associés dans l’espace sous-rétinien afin de traiter les maladies rétiniennes. L’administration sous-rétinienne de composés pharmaceutiques et de cellules dans le modèle murin est difficile en raison de la contrainte de la taille du globe oculaire murin. Ce protocole décrit la procédure détaillée pour la préparation des cellules progénitrices photoréceptrices dérivées de l’hESC pour injection et la technique d’administration sous-rétinienne de ces cellules chez les souris mutantes de la rétinite pigmentaire génétique, rd10 . Cette approche permet d’opérer une thérapie cellulaire dans la zone ciblée, en particulier dans la couche nucléaire externe de la rétine, où se produisent les maladies conduisant à la dégénérescence des photorécepteurs.

Introduction

Les maladies héréditaires de la rétine et la dégénérescence maculaire liée à l’âge entraînent une perte de cellules photoréceptrices et éventuellement la cécité. Le photorécepteur rétinien est la couche du segment externe de la rétine composée de cellules spécialisées responsables de la phototransduction (c’est-à-dire la conversion de la lumière en signaux neuronaux). Les cellules photoréceptrices en bâtonnets et en cônes sont adjacentes à la couche pigmentée rétinienne (EPR)¹. La thérapie de remplacement des cellules photoréceptrices pour compenser la perte cellulaire est une approche thérapeutique émergente et en développement. Des cellules s....

Protocole

Les expériences in vivo ont été réalisées conformément aux directives et au protocole approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de SingHealth (IACUC) et la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Les chiots ont été immunodéprimés de P17 (avant la transplantation) à P30 (après la transplantation) en les nourrissant avec de l’eau potable contenant de la cyclosporine (260 g/L).

1. Préparation des progéniteurs de photorécepteurs dérivés de l’ESC au jour 32 après cryoconservation<....

Discussion

L’injection sous-rétinienne a été utilisée pour la transplantation de suspension cellulaire pour traiter l’EPR et les maladies de la rétine 23,25,26,27,28,31,40. Cette approche est très essentielle dans les études sur les rongeurs, non seulement pour les approches de transplantati.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3% Tobramycin	Novartis	NDC  0078-0813-01	Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone	Novartis	NDC 0078-0876-01	Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0016-15	0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringe	Turemo	SS01T2713
1% Tropicamide	Alcon	NDC 0998-0355-15	1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0342-05	2.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plate	Costar	3526
30 G Disposable needle	Becton Dickinson (BD)	305128
33 G, 20 mm length blunt needles	Hamilton	7803-05
Automated Cell Counter	NanoEnTek	Model: Eve
B27 without Vitamin A	Life Technologies	12587001	2%36
Buprenorphine	Ceva		Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7	Sigma	C0742	5 µM36
Cyclosporine	Novartis		260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells	DUKE-NUS Medical School		Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
Gauze	Winner Industries Co. Ltd.	1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential Medium	Gibco	11710–035
hESC cell line H1	WiCell Research Institute	WA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02-50	10 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Prospec-Tany Technogene	CYT-272	10 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)	Ceva Santé Animale	KETALAB03
LN-521	Biolamina	LN521-02	1 µg36
mFreSR	STEMCELL Technologies	5854
Microlitre glass syringe (10 mL)	Hamilton	7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)	Selleckchem	S2215	10 µM36
N-2 supplement	Life Technologies	A13707-01	1%36
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140–050	1x36
NutriStem XF Media	Satorius	05-100-1A
Operating microscope	Zeiss	OPMI LUMERA 700	With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)	DUKE-NUS Medical School		See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
Pyruvate	Gibco	11360–070	1 mM36
Rd10 mice	Jackson Laboratory	B6.CXB1-Pde6brd10/J mice	Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g
Retinoic acid	Tocris Bioscience	0695/50	0.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)	Fisher Scientific	12-545-80
SB431542	Sigma	S4317	0.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)	Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)	Troy Laboratories	LI0605
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985–023	0.1 mM36