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  • matériels
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Résumé

Nous décrivons un protocole détaillé pour la préparation de cellules progénitrices photoréceptrices dérivées de hESC post-cryopréservées et l’administration sous-rétinienne de ces cellules chez des souris rd10 .

Résumé

La régénération des cellules photoréceptrices à l’aide de cellules souches pluripotentes humaines est une thérapie prometteuse pour le traitement des maladies rétiniennes héréditaires et vieillissantes à des stades avancés. Nous avons montré que la matrice isoforme de laminine recombinante spécifique de la rétine humaine est capable de soutenir la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en progéniteurs de photorécepteurs. De plus, l’injection sous-rétinienne de ces cellules a également montré une restauration partielle dans les modèles de rongeurs et de lapins rd10 . L’injection sous-rétinienne est connue pour être une méthode établie qui a été utilisée pour délivrer des composés pharmaceutiques aux cellules photoréceptrices et à la couche épithéliale pigmentée rétinienne (EPR) de l’œil en raison de sa proximité avec l’espace cible. Il a également été utilisé pour délivrer des vecteurs viraux adéno-associés dans l’espace sous-rétinien afin de traiter les maladies rétiniennes. L’administration sous-rétinienne de composés pharmaceutiques et de cellules dans le modèle murin est difficile en raison de la contrainte de la taille du globe oculaire murin. Ce protocole décrit la procédure détaillée pour la préparation des cellules progénitrices photoréceptrices dérivées de l’hESC pour injection et la technique d’administration sous-rétinienne de ces cellules chez les souris mutantes de la rétinite pigmentaire génétique, rd10 . Cette approche permet d’opérer une thérapie cellulaire dans la zone ciblée, en particulier dans la couche nucléaire externe de la rétine, où se produisent les maladies conduisant à la dégénérescence des photorécepteurs.

Introduction

Les maladies héréditaires de la rétine et la dégénérescence maculaire liée à l’âge entraînent une perte de cellules photoréceptrices et éventuellement la cécité. Le photorécepteur rétinien est la couche du segment externe de la rétine composée de cellules spécialisées responsables de la phototransduction (c’est-à-dire la conversion de la lumière en signaux neuronaux). Les cellules photoréceptrices en bâtonnets et en cônes sont adjacentes à la couche pigmentée rétinienne (EPR)1. La thérapie de remplacement des cellules photoréceptrices pour compenser la perte cellulaire est une approche thérapeutique émergente et en développement. Des cellules souches embryonnaires (CSE)2,3,4, des cellules RPE dérivées de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) et des cellules progénitrices de la rétine (CPR)4,5,6,7,8 ont été utilisées pour restaurer les cellules photoréceptrices endommagées. L’espace sous-rétinien, un espace confiné entre la rétine et l’EPR, est un endroit attrayant pour déposer ces cellules afin de remplacer les cellules photoréceptrices endommagées, l’EPR et les cellules de Mueller en raison de sa proximité 9,10,11.

Les thérapies géniques et cellulaires ont utilisé l’espace sous-rétinien pour la médecine régénérative pour diverses maladies de la rétine dans le cadre d’études précliniques. Cela comprend la livraison de copies fonctionnelles du gène ou d’outils d’édition de gènes sous la forme d’une thérapie oligonucléotidique anti-sens12,13 ou CRISPR/Cas9 ou de l’édition de bases via une stratégie basée sur le virus adéno-associé (AAV) 14,15,16, l’implantation de matériaux (par exemple, feuille RPE, prothèses rétiniennes 17,18,19) et d’organoïdes rétiniens différenciés dérivés de cellules souches 20,21,22 pour traiter les maladies de la rétine et les maladies liées à l’EPR. Essais cliniques utilisant hESC-RPE31 dans l’espace sous-rétinien pour traiter l’amaurose congénitale (ACL) de Leber associée à RPE6523,24, l’achromatopsie liée à CNGA325, la rétinite pigmentaire associée à MERTK26, la choroïdérémie 27,28,29,30 se sont avérés être une approche efficace. L’injection directe de cellules à proximité de la zone endommagée améliore considérablement les chances de règlement des cellules dans la région appropriée, l’intégration synaptique et l’amélioration visuelle éventuelle.

Même si l’injection sous-rétinienne dans des modèles humains et à grands yeux (c’est-à-dire le porc32, 33, 34, 35, le lapin36, 37, 38, 39, 40 et le primate non humain41, 42, 43) a été établie, une telle injection dans le modèle murin est toujours difficile en raison de la contrainte de la taille du globe oculaire et de l’énorme lentille occupant l’œil de la souris 44,45,46. Cependant, les modèles génétiquement modifiés ne sont facilement disponibles que chez les petits animaux et non chez les grands animaux (c’est-à-dire les lapins et les primates non humains), c’est pourquoi l’injection sous-rétinienne chez la souris attire l’attention sur l’étude de nouvelles approches thérapeutiques dans les maladies génétiques rétiniennes. Trois approches principales sont utilisées pour délivrer des cellules ou des AAV dans l’espace sous-rétinien, à savoir la voie transcornéenne, la voie trans-sclérale et la voie de la pars plana (voir la figure 2). Les voies transcornéennes et transsclérales sont associées à la formation de cataracte, aux synéchies, aux saignements choroïdiens et au reflux du site d’injection 11,44,45,47,48,49. Nous avons adopté l’approche pars plana comme visualisation directe du processus d’injection, et le site d’injection peut être réalisé en temps réel au microscope.

Nous avons récemment décrit une méthode qui permet de différencier les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en progéniteurs photorécepteurs dans des conditions chimiquement définies sans xéno, en utilisant l’isoforme LN523 de laminine humaine recombinante spécifique à la rétine. Étant donné que LN523 s’est avéré être présent dans la rétine, nous avons émis l’hypothèse que la niche de la matrice extracellulaire de la rétine humaine pourrait être récapitulée in vitro et ainsi soutenir la différenciation des photorécepteurs à partir des hESCs36. L’analyse transcriptomique unicellulaire a montré que les progéniteurs photorécepteurs co-exprimant l’homéobox cône-bâtonnet et la récupérine ont été générés après 32 jours. Un modèle murin mutant de dégénérescence rétinienne 10 (rd10) qui imite la rétinite pigmentaire humaine autosomique a été utilisé pour évaluer l’efficacité des progéniteurs photorécepteurs dérivés de hESC au jour 32 in vivo. Les cellules progénitrices photoréceptrices dérivées de hESC ont été injectées dans l’espace sous-rétinien de souris rd10 à P20, où le dysfonctionnement et la dégénérescence des photorécepteurs sont en cours36. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la préparation des progéniteurs photorécepteurs dérivés de hESC post-cryoconservés et leur livraison dans l’espace sous-rétinien des souris rd10 . Cette méthode peut également être utilisée pour administrer des AAV, des suspensions cellulaires, des peptides ou des produits chimiques dans l’espace sous-rétinien chez la souris.

Protocole

Les expériences in vivo ont été réalisées conformément aux directives et au protocole approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de SingHealth (IACUC) et la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Les chiots ont été immunodéprimés de P17 (avant la transplantation) à P30 (après la transplantation) en les nourrissant avec de l’eau potable contenant de la cyclosporine (260 g/L).

1. Préparation des progéniteurs de photorécepteurs dérivés de l’ESC au jour 32 après cryoconservation

  1. Préchauffer le milieu de différenciation des photorécepteurs (PRDM) dans un bain-marie à 37 °C.
  2. Récupérer un flacon cryogénique contenant des cellules progénitrices photoréceptrices dérivées de l’ESC au jour 32 à partir de l’azote liquide. Conserver sur de la glace sèche.
  3. Décongeler le cryoflacon à 37 °C au bain-marie pendant 3 à 5 minutes. Remettre en suspension le jour 32 cellules dans 1 mL de PRDM et centrifuger à 130 x g pendant 4 min.
  4. Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de PRDM.
  5. Retirer 10 μL du mélange pour le comptage des cellules. Mélanger les cellules en utilisant 0,2 % de bleu de trypan selon les instructions du fabricant. Pipeter le mélange de cellules dans la lame de la chambre de comptage des cellules. Déterminez le nombre et la viabilité des cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
  6. Passez à l’étape suivante lorsque la viabilité cellulaire est supérieure à 70 %. Centrifuger la suspension cellulaire restante à 130 x g pendant 4 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans le PRDM à la concentration de 3 x 105 cellules/μL pour la transplantation.
  7. Observez les amas de cellules visibles. Remettre en suspension les amas cellulaires à plusieurs reprises à l’aide d’une pointe de pipette de 10 μL dans le tube du microfuge jusqu’à ce qu’aucun amas cellulaire visible ne soit observé. Chargez dans la seringue d’injection 33G pour observer l’extrusion de la solution cellulaire à travers l’aiguille.

2. Délivrance sous-rétinienne des hESCs chez les souris rd10

  1. Préparation des animaux
    1. Anesthésier la souris (P20, mâle/femelle, 3-6 g) à l’aide d’une combinaison de kétamine (20 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (2 mg/kg de poids corporel) dans une seringue de tuberculine de 1 mL fixée à une aiguille 27G par voie intrapéritonéale. Administrer une injection sous-cutanée de buprénorphine (0,05 mg/kg) à la souris comme analgésique préventif.
    2. Après l’administration de l’anesthésie, instiller une goutte de 1 % de tropicamide et de 2,5 % de phényléphrine pour la dilatation de la pupille. Appliquez un gel ophtalmique sur la cornée pour prévenir la sécheresse oculaire et la cataracte liée à l’anesthésie.
    3. Placez la souris dans une cage vide jusqu’à ce qu’elle soit complètement anesthésiée. Évaluez le niveau d’anesthésie approprié en pinçant le coussinet et confirmez si l’animal ne réagit pas au pincement dur.
    4. Lorsque la souris est complètement anesthésiée, placez l’animal sur un tampon chaud réglé à 38 °C.
  2. Délivrance sous-rétinienne des cellules
    1. Pour utiliser une approche pars plana trans-vitréenne à 1 port, comme c’est le cas ici, effectuer une injection sous-rétinienne dans un environnement stérile. Utilisez un microscope opératoire vertical avec un trajet de lumière directe pour effectuer l’injection.
    2. Préparez la seringue en verre de 10 μL en retirant l’embout de l’aiguille. Montez l’aiguille émoussée 33G sur la seringue en verre. Prenez le couvercle du moyeu métallique et fixez soigneusement l’aiguille sur la seringue.
    3. Rincez à l’eau distillée pour vérifier s’il y a des signes de fuite et de perméabilité de l’aiguille. Videz la seringue et placez-la sur le côté avec précaution.
    4. Placez la souris anesthésiée sur un oreiller, l’œil de traitement regardant directement vers l’objectif du microscope. Appliquez le chlorhydrate de proparacaïne à 0,5 % et attendez 30 s. Appliquez 150 μL de gel ophtalmique sur l’œil et placez une lamelle ronde dessus.
    5. Effectuez un examen approximatif de l’œil en observant la cornée, l’iris, la pupille, le cristallin et la conjonctive. À travers la pupille, visualisez le fond d’œil de la souris en ajustant le plan focal. Ajustez la tête jusqu’à ce que la tête optique soit positionnée au centre de la pupille et minimisez le mouvement de la tête en la positionnant correctement sur l’oreiller.
    6. Tapotez doucement la base du tube avec les hESC plusieurs fois pour obtenir une suspension cellulaire uniforme. À l’aide de la seringue de microlitres en verre de 10 μL avec une aiguille émoussée de 33 G, prélever 2 μL de cellules/milieux. Prélever les cellules juste avant l’injection pour éviter que les cellules ne s’agglutinent/ne s’agglutinent dans la seringue.
    7. À l’aide d’une aiguille jetable de 30 G, faites une plaie de sclérectomie à 2 mm derrière le limbe. Maintenez l’angle de l’aiguille à ~45° pour éviter de toucher la lentille. Une fois que la pointe de l’aiguille est visualisée dans le chas de l’aiguille, retirez délicatement l’aiguille. Jetez l’aiguille dans le bac pointu après utilisation pour éviter les blessures par piqûre d’aiguille.
    8. Prenez la seringue en verre et insérez l’aiguille émoussée dans la plaie de sclérectomie. Sans toucher la lentille, faites avancer l’aiguille émoussée jusqu’à ce qu’elle atteigne la rétine opposée à la plaie d’entrée. Assurez-vous que la zone d’injection est dégagée des principaux vaisseaux sanguins de la rétine pour éviter les saignements.
    9. Pénétrez doucement dans la rétine jusqu’à ce qu’une branche de pression sur la sclérotique soit visible. Gardez l’extrémité émoussée de l’aiguille parallèle à la sclérotique pour éviter la fuite des cellules dans l’espace vitré.
    10. Injecter lentement 2 μL de suspension cellulaire ou de milieu PRDM (témoin) dans l’espace sous-rétinien tout en maintenant une légère pression sur la seringue. Lors d’une injection réussie, une tache visible (c’est-à-dire une rétine surélevée avec la suspension cellulaire ou le milieu à l’intérieur) devrait se former au site d’injection.
      REMARQUE : Seule une légère pression doit être utilisée pendant l’injection pour éviter la déchirure de la rétine et le blocage des cellules à l’extrémité de l’aiguille.
    11. Après avoir confirmé la tache, attendez 10 s pour laisser les cellules se déposer. Rétractez doucement l’aiguille de l’œil.
  3. Tomographie par cohérence optique peropératoire (OCT) de la bulle (facultatif)
    1. Positionnez l’œil de la souris pour visualiser la tache au microscope en déplaçant lentement la tête. Fixez la position en tenant doucement la tête. Aucune dilatation supplémentaire de la pupille n’est nécessaire. Ne retirez pas la lamelle et le gel sur l’œil. Il donne un support optique clair pour visualiser la bleb.
    2. Effectuez l’OCT peropératoire à l’aide de la fonction iOCT intégrée du microscope opératoire.
    3. Appuyez sur l’option Cube sur l’écran OCT et positionnez la zone de numérisation sur le bleb en appuyant sur les boutons fléchés . Ajustez l’OCT en faisant glisser Centrage et Mise au point pour obtenir la meilleure qualité d’OCT. Appuyez sur Capture/Scan pour obtenir le scan OCT de la zone de bleb. Examinez les images pour vérifier la qualité des numérisations.
  4. Récupération
    1. Retirez la lamelle et nettoyez le gel de l’œil avec de la gaze. Appliquez une pommade antibiotique une fois après l’injection pour prévenir l’infection.
    2. Laissez l’animal se remettre de l’anesthésie sous une lumière chaude jusqu’à ce qu’il retrouve suffisamment de conscience pour maintenir sa position couchée sternale et retourner dans sa cage d’origine. Surveillez l’animal pendant au moins 3 jours après l’injection pour détecter des signes d’inflammation, d’infection et de détresse.
      REMARQUE : La lumière chaude de 150 W doit être à au moins 30 cm de la cage de l’animal et des précautions doivent être prises pour éviter une brûlure.
    3. Administrer une injection sous-cutanée de buprénorphine (0,05 mg/kg) 8 heures pendant 1 jour ou selon les recommandations du vétérinaire. Si une inflammation ou une infection de l’œil est observée, consultez un professionnel vétérinaire pour un traitement approprié.
  5. Nettoyage et stérilisation des instruments
    1. Rincez la seringue microlitre en verre de 10 μL et l’aiguille émoussée 33G avec 100 % éthanol 10x. Lavez l’éthanol en flashant la seringue avec de l’eau distillée.
    2. Démontez la seringue en verre et l’aiguille. Séchez la seringue pour la ranger.

Résultats

La seringue en verre de 10 μL a été assemblée conformément aux instructions du fabricant (figure 1), et l’aiguille émoussée utilisée pour administrer la suspension cellulaire ou le milieu est illustrée à la figure 1B. Différentes approches pour l’injection sous-rétinienne sont illustrées à la figure 2. Nous décrivons l’approche pars plana dans ce protocole (Figure 2C). L’aiguille ...

Discussion

L’injection sous-rétinienne a été utilisée pour la transplantation de suspension cellulaire pour traiter l’EPR et les maladies de la rétine 23,25,26,27,28,31,40. Cette approche est très essentielle dans les études sur les rongeurs, non seulement pour les approches de transplantati...

Déclarations de divulgation

Hwee Goon Tay est cofondateur d’Alder Therapeutics AB. D’autres auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Nous remercions Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee et Yingying Chung pour leur assistance technique pour la préparation des progéniteurs de photorécepteurs dérivés de l’ESC h après cryoconservation. Ces travaux ont été financés en partie par des subventions de la bourse de subvention de recherche pour jeunes chercheurs du Conseil national de recherches médicales (NMRC/OFYIRG/0042/2017) et de la subvention du 24e programme de recherche concurrentielle de la National Research Foundation (CRP24-2020-0083) à H.G.T.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.3% TobramycinNovartisNDC  0078-0813-01Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% DexamethasoneNovartisNDC 0078-0876-01Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochlorideAlconNDC 0998-0016-150.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringeTuremoSS01T2713
1% TropicamideAlconNDC 0998-0355-151% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochlorideAlconNDC 0998-0342-052.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plateCostar3526
30 G Disposable needleBecton Dickinson (BD)305128
33 G, 20 mm length blunt needlesHamilton7803-05
Automated Cell CounterNanoEnTekModel: Eve
B27 without Vitamin ALife Technologies125870012%36
BuprenorphineCevaVetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7SigmaC07425 µM36
CyclosporineNovartis260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cellsDUKE-NUS Medical SchoolHuman embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
GauzeWinner Industries Co. Ltd.1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential MediumGibco11710–035
hESC cell line H1WiCell Research InstituteWA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)Peprotech450-02-5010 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)Prospec-Tany TechnogeneCYT-27210 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)Ceva Santé AnimaleKETALAB03
LN-521BiolaminaLN521-021 µg36
mFreSRSTEMCELL Technologies5854
Microlitre glass syringe (10 mL)Hamilton7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)SelleckchemS221510 µM36
N-2 supplementLife TechnologiesA13707-011%36
Non-essential amino acids (NEAA)Gibco11140–0501x36
NutriStem XF MediaSatorius05-100-1A
Operating microscopeZeissOPMI LUMERA 700With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)DUKE-NUS Medical SchoolSee media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
PyruvateGibco11360–0701 mM36
Rd10 miceJackson LaboratoryB6.CXB1-Pde6brd10/J miceGender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g 
Retinoic acidTocris Bioscience0695/500.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)Fisher Scientific12-545-80
SB431542SigmaS43170.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)Troy LaboratoriesLI0605
β-mercaptoethanolLife Technologies21985–0230.1 mM36

Références

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