Subretinale Verabreichung von Photorezeptor-Vorläuferzellen aus humanen embryonalen Stammzellen in rd10-Mäusen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Präparation von post-kryokonservierten hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen und die subretinale Verabreichung dieser Zellen in rd10-Mäusen .

Zusammenfassung

Die Regeneration von Photorezeptorzellen mit humanen pluripotenten Stammzellen ist eine vielversprechende Therapie für die Behandlung von erblichen und alternden Netzhauterkrankungen in fortgeschrittenen Stadien. Wir haben gezeigt, dass die humane rekombinante retina-spezifische Laminin-Isoform-Matrix in der Lage ist, die Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) zu Photorezeptor-Vorläuferzellen zu unterstützen. Darüber hinaus hat die subretinale Injektion dieser Zellen auch eine teilweise Wiederherstellung in den rd10-Nagetier - und Kaninchenmodellen gezeigt. Es ist bekannt, dass die subretinale Injektion eine etablierte Methode ist, die verwendet wurde, um pharmazeutische Verbindungen zu den Photorezeptorzellen und der retinalen pigmentierten Epithelschicht (RPE) des Auges zu bringen, da sie sich in der Nähe des Zielraums befindet. Es wurde auch verwendet, um Adeno-assoziierte virale Vektoren in den subretinalen Raum zu bringen, um Netzhauterkrankungen zu behandeln. Die subretinale Verabreichung von pharmazeutischen Verbindungen und Zellen im Mausmodell ist aufgrund der begrenzten Größe des murinen Augapfels eine Herausforderung. Dieses Protokoll beschreibt das detaillierte Verfahren zur Vorbereitung von hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen für die Injektion und die subretinale Verabreichungstechnik dieser Zellen in genetischen Retinitis pigmentosa-Mutanten, rd10-Mäusen . Dieser Ansatz ermöglicht die Zelltherapie in den Zielbereich, insbesondere in die äußere Kernschicht der Netzhaut, wo Krankheiten auftreten, die zu einer Degeneration der Photorezeptoren führen.

Einleitung

Erbliche Netzhauterkrankungen und altersbedingte Makuladegeneration führen zum Verlust von Photorezeptorzellen und schließlich zur Erblindung. Der retinale Photorezeptor ist die äußere Segmentschicht der Netzhaut, die aus spezialisierten Zellen besteht, die für die Phototransduktion (d. h. die Umwandlung von Licht in neuronale Signale) verantwortlich sind. Die Stäbchen- und Zapfen-Photorezeptorzellen grenzen an die retinale pigmentierte Schicht (RPE)¹. Die Photorezeptor-Zellersatztherapie zur Kompensation des Zellverlustes ist ein aufkommender und sich entwickelnder therapeutischer Ansatz. Embryonale Stammzellen (ESCs)^2,3,4, induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) und retinale Vorläuferzellen (RPCs⁾4,5,6,7,8 wurden verwendet, um die geschädigten Photorezeptorzellen wiederherzustellen. Der subretinale Raum, ein begrenzter Raum zwischen der Netzhaut und dem RPE, ist aufgrund seiner Nähe ein attraktiver Ort, um diese Zellen abzulagern, um beschädigte Photorezeptorzellen, RPE und Mueller-Zellen zu ersetzen ^9,10,11.

Gen- und Zelltherapien haben in präklinischen Studien den subretinalen Raum für die regenerative Medizin bei verschiedenen Netzhauterkrankungen genutzt. Dies umfasst die Verabreichung von funktionellen Kopien des Gens oder von Gen-Editierungswerkzeugen in Form von entweder Anti-Sense-Oligonukleotid-Therapie^12,13 oder CRISPR/Cas9 oder Base-Editierung über eine auf Adeno-assoziierten Viren (AAV) basierende Strategie 14,15,16, Implantation von Materialien (z. B. RPE-Folie, Netzhautprothetik 17,18,19) und differenzierten aus Stammzellen gewonnenen Netzhaut-Organoiden ^20,21,22 zur Behandlung von Netzhaut- und RPE-bedingten Erkrankungen. Klinische Studien mit hESC-RPE³¹ im subretinalen Raum zur Behandlung der RPE65-assoziierten Leber-kongenitalen Amaurose (LCA)^23,24, der CNGA3-verknüpften Achromatopsie²⁵, der MERTK-assoziierten Retinitis pigmentosa²⁶ und der Choroiderämie 27,28,29,30 haben sich als wirksamer Ansatz erwiesen. Die direkte Injektion von Zellen in die Nähe des geschädigten Bereichs verbessert die Wahrscheinlichkeit einer Zellansiedlung in der entsprechenden Region, der synaptischen Integration und schließlich einer visuellen Verbesserung erheblich.

Obwohl die subretinale Injektion in menschlichen und großäugigen Modellen (d. h. Schwein 32,33,34,35, Kaninchen 36,37,38,39,40 und nicht-menschliche Primaten 41,42,43) etabliert wurde, ist eine solche Injektion im Mausmodell aufgrund der eingeschränkten Größe des Augapfels und enormer Linse, die das Mausauge einnimmt 44,45,46. Genetisch veränderte Modelle sind jedoch nur bei Kleintieren und nicht bei Großtieren (d.h. Kaninchen und nicht-menschlichen Primaten) verfügbar, daher lenkt die subretinale Injektion in Mäuse die Aufmerksamkeit auf die Erforschung neuer therapeutischer Ansätze bei retinalen genetischen Erkrankungen. Drei Hauptansätze werden verwendet, um Zellen oder AAVs in den subretinalen Raum zu bringen, nämlich die transkorneale Route, die transsklerale Route und die Pars-plana-Route (siehe Abbildung 2). Transkorneale und transsklerale Wege sind mit Kataraktbildung, Synechien, Aderhautblutungen und Reflux von der Injektionsstelle assoziiert 11,44,45,47,48,49. Wir haben den Pars-Plana-Ansatz als direkte Visualisierung des Injektionsprozesses gewählt, und die Injektionsstelle kann in Echtzeit unter dem Mikroskop erreicht werden.

Wir haben kürzlich eine Methode beschrieben, mit der humane embryonale Stammzellen (hES-Zellen) unter xenofreien, chemisch definierten Bedingungen unter Verwendung der rekombinanten humanen Retina-spezifischen Laminin-Isoform LN523 in Photorezeptor-Vorläuferzellen differenziert werden können. Da LN523 in der Netzhaut gefunden wurde, stellten wir die Hypothese auf, dass die extrazelluläre Matrixnische der menschlichen Netzhaut in vitro rekapituliert werden könnte und dadurch die Photorezeptordifferenzierung von den hES-Zellen unterstützt^{werden könnte 36}. Die einzellige Transkriptomanalyse zeigte, dass nach 32 Tagen Photorezeptor-Vorläuferzellen erzeugt wurden, die Zapfenstäbchen-Homöobox und Recoverin coexprimieren. Ein retinal degeneration 10 (rd10) mutiertes Mausmodell, das die autosomale humane Retinitis pigmentosa nachahmt, wurde verwendet, um die Wirksamkeit der day 32 hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen in-vivo zu untersuchen. Die hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen wurden in den subretinalen Raum von rd10-Mäusen bei P20 injiziert, wo Photozeptor-Dysfunktion und -Degeneration andauern³⁶. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Herstellung der postkryokonservierten hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen und die Abgabe in den subretinalen Raum von rd10-Mäusen . Diese Methode kann auch verwendet werden, um AAVs, Zellsuspensionen, Peptide oder Chemikalien in den subretinalen Raum von Mäusen zu verabreichen.

Protokoll

Die In-vivo-Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) und der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung genehmigt wurden. Die Welpen wurden von P17 (vor der Transplantation) auf P30 (nach der Transplantation) immunsupprimiert, indem sie mit Ciclosporin (260 g/L) gefüttert wurden.

1. Präparation von Tag 32 hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen nach Kryokonservierung

1. Photorezeptor-Differenzierungsmedium (PRDM) in einem 37 °C warmen Wasserbad vorwärmen.
2. Entnahme eines Kryo-Fröhrchens mit Tag-32-hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen aus flüssigem Stickstoff. Auf Trockeneis aufbewahren.
3. Das Kryoröhrchen bei 37 °C im Wasserbad 3-5 min auftauen. 32 Zellen in 1 ml PRDM resuspendieren und 4 Minuten lang bei 130 x g zentrifugieren.
4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml PRDM.
5. Entnehmen Sie 10 μl der Mischung für die Zellzählung. Mischen Sie die Zellen mit 0,2 % Trypanblau gemäß den Anweisungen des Herstellers. Pipettieren Sie die Zellmischung in den Objektträger der Zellzählkammer. Bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit durch einen automatisierten Zellzähler.
6. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, wenn die Zelllebensfähigkeit über 70 % liegt. Die verbleibende Zellsuspension wird bei 130 x g für 4 min zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in PRDM in einer Konzentration von 3 x 10⁵ Zellen/μl für die Transplantation.
7. Achten Sie auf sichtbare Zellklumpen. Resuspendieren Sie Zellklumpen wiederholt mit einer 10-μl-Pipettenspitze im Mikrofugenröhrchen, bis kein sichtbarer Zellklumpen mehr zu sehen ist. In die 33G-Injektionsspritze geben, um die Extrusion der Zelllösung durch die Nadel zu beobachten.

2. Subretinale Verabreichung der hES-Zellen in rd10-Mäusen

1. Vorbereitung der Tiere
   1. Die Betäubung der Maus (P20, männlich/weiblich, 3-6 g) mit einer Kombination aus Ketamin (20 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (2 mg/kg Körpergewicht) in einer 1-ml-Tuberkulinspritze, die an einer 27G-Nadel befestigt ist, mittels intraperitonealem Zugang. Verabreichen Sie der Maus eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0,05 mg/kg) als vorbeugendes Analgetikum.
   2. Nach der Verabreichung der Anästhesie träufeln Sie je einen Tropfen 1 % Tropicamid und 2,5 % Phenylephrin zur Pupillenerweiterung. Tragen Sie ein ophthalmisches Gel auf die Hornhaut auf, um das Auge vor Trockenheit und anästhesiebedingtem Katarakt zu schützen.
   3. Legen Sie die Maus in einen leeren Käfig, bis sie vollständig betäubt ist. Beurteilen Sie die richtige Betäubungsstufe, indem Sie den Pfotenballen zusammenkneifen, und vergewissern Sie sich, dass das Tier nicht auf das harte Kneifen reagiert.
   4. Wenn die Maus vollständig betäubt ist, legen Sie das Tier auf eine warme Unterlage bei 38 °C.
2. Subretinale Verabreichung der Zellen
   1. Um einen 1-Port-transvitrealen Pars-plana-Ansatz zu verwenden, wie hier durchgeführt, führen Sie eine subretinale Injektion in einer sterilen Umgebung durch. Verwenden Sie für die Injektion ein aufrecht stehendes Operationsmikroskop mit direktem Strahlengang.
   2. Bereiten Sie die 10-μl-Glasspritze vor, indem Sie den Nadelansatz entfernen. Montieren Sie die stumpfe 33G-Nadel auf die Glasspritze. Nehmen Sie die Metallnabenabdeckung und befestigen Sie die Nadel vorsichtig auf der Spritze.
   3. Spülen Sie mit destilliertem Wasser, um zu prüfen, ob die Nadel undicht ist und durchgängig ist. Entleeren Sie die Spritze und legen Sie sie vorsichtig an die Seite.
   4. Legen Sie die betäubte Maus auf ein Kissen, wobei das Behandlungsauge direkt auf das Mikroskop blickt. Tragen Sie das 0,5%ige Proparacainhydrochlorid auf und warten Sie 30 Sekunden. Tragen Sie 150 μl Augengel auf das Auge auf und legen Sie ein rundes Deckglas darauf.
   5. Führe eine grobe Untersuchung des Auges durch, indem du die Hornhaut, die Iris, die Pupille, die Linse und die Bindehaut beobachtest. Visualisieren Sie durch die Pupille den Fundus des Mausauges, indem Sie die Fokusebene anpassen. Stellen Sie den Kopf so lange ein, bis sich der optische Kopf in der Mitte der Pupille befindet, und minimieren Sie die Bewegung des Kopfes durch die richtige Positionierung auf dem Kissen.
   6. Klopfen Sie mehrmals vorsichtig auf den Boden des Röhrchens mit den hES-Zellen, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu erhalten. Entnehmen Sie mit der 10-μl-Glasmikroliterspritze mit einer stumpfen 33G-Nadel 2 μl Zellen/Medien. Entnehmen Sie die Zellen kurz vor der Injektion, um eine Zellabsetzung/Verklumpung in der Spritze zu vermeiden.
   7. Machen Sie mit einer 30-G-Einwegnadel eine Sklerektomiewunde 2 mm hinter dem Limbus. Halten Sie den Winkel der Nadel bei ~45°, um eine Berührung der Linse zu vermeiden. Sobald die Nadelspitze im Auge sichtbar ist, ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück. Entsorgen Sie die Nadel nach Gebrauch in den scharfen Behälter, um Verletzungen durch Nadelstiche zu vermeiden.
   8. Nehmen Sie die Glasspritze und führen Sie die stumpfe Nadel in die Sklerektomiewunde ein. Ohne die Linse zu berühren, schieben Sie die stumpfe Nadel vor, bis sie die gegenüberliegende Netzhaut der Eintrittswunde erreicht. Stellen Sie sicher, dass der Injektionsbereich frei von großen Blutgefäßen der Netzhaut ist, um Blutungen zu vermeiden.
   9. Sanft in die Netzhaut eindringen, bis ein Druckzweig auf der Sklera zu sehen ist. Halten Sie das stumpfe Ende der Nadel parallel zur Sklera, um ein Austreten der Zellen in den Glaskörper zu vermeiden.
   10. Injizieren Sie langsam 2 μl Zellsuspension oder PRDM-Medien (Kontrolle) in den subretinalen Raum, während der Druck auf die Spritze sanft aufrechterhalten wird. Nach einer erfolgreichen Injektion sollte sich an der Injektionsstelle eine sichtbare Blase (d. h. eine erhabene Netzhaut mit der Zellsuspension/dem darin enthaltenen Medium) bilden.
       HINWEIS: Während der Injektion sollte nur sanfter Druck ausgeübt werden, um ein Einreißen der Netzhaut und eine Verstopfung der Zellen an der Nadelspitze zu vermeiden.
   11. Nachdem Sie das Bläschen bestätigt haben, warten Sie 10 Sekunden, damit sich die Zellen beruhigt haben. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig aus dem Auge zurück.
3. Intraoperative optische Kohärenztomographie (OCT) der Blase (optional)
   1. Positionieren Sie das Mausauge, um die Blase unter dem Mikroskop sichtbar zu machen, indem Sie den Kopf langsam bewegen. Sichern Sie die Position, indem Sie den Kopf sanft festhalten. Eine zusätzliche Pupillenerweiterung ist nicht notwendig. Entfernen Sie nicht das Deckglas und das Gel auf dem Auge. Es bietet ein klares optisches Medium, um die Blase zu visualisieren.
   2. Führen Sie die intraoperative OCT mit der integrierten iOCT-Funktion des Operationsmikroskops durch.
   3. Drücken Sie die Option Cube auf dem OCT-Bildschirm und positionieren Sie den Scanbereich auf dem Bleb, indem Sie die Pfeiltasten drücken. Passen Sie das OAT an, indem Sie Zentrierung und Fokus verschieben, um die beste OCT-Qualität zu erzielen. Drücken Sie auf Erfassen/Scannen , um den OCT-Scan des Brütchenbereichs zu erhalten. Überprüfen Sie die Bilder, um die Qualität der Scans zu überprüfen.
4. Genesung
   1. Entfernen Sie das Deckglas und reinigen Sie das Gel mit Gaze. Tragen Sie einmal nach der Injektion eine antibiotische Salbe auf, um eine Infektion zu verhindern.
   2. Lassen Sie das Tier unter warmem Licht von der Narkose erholen, bis es wieder zu Bewusstsein kommt, um das Brustbein zu behalten und in den häuslichen Käfig zurückzukehren. Überwachen Sie das Tier mindestens 3 Tage nach der Injektion auf Anzeichen von Entzündungen, Infektionen und Stress.
      HINWEIS: Das 150 W warme Licht sollte mindestens 30 cm vom Tierkäfig entfernt sein, und es ist Vorsicht geboten, um eine Verbrennung zu vermeiden.
   3. Verabreichen Sie eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0,05 mg/kg) 8 stündlich für 1 Tag oder nach Empfehlung des Tierarztes. Wenn eine Entzündung oder Infektion des Auges beobachtet wird, konsultieren Sie einen Tierarzt für eine angemessene Behandlung.
5. Reinigung und Sterilisation der Instrumente
   1. Spülen Sie die 10-μl-Glasmikroliterspritze und die stumpfe 33G-Nadel 10x mit 100% Ethanol. Waschen Sie das Ethanol ab, indem Sie die Spritze mit destilliertem Wasser aufblitzen lassen.
   2. Zerlegen Sie die Glasspritze und die Nadel. Trocknen Sie die Spritze zur Aufbewahrung.

Ergebnisse

Die 10-μl-Glasspritze wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers zusammengebaut (Abbildung 1), und die stumpfe Nadel, die zur Abgabe der Zellsuspension/des Mediums verwendet wird, ist in Abbildung 1B dargestellt. Verschiedene Ansätze für die subretinale Injektion sind in Abbildung 2 dargestellt. In diesem Protokoll beschreiben wir den Pars-Plana-Ansatz (Abbildung 2C). Die stumpfe Nadel, die auf ei...

Diskussion

Die subretinale Injektion wurde für die Zellsuspensionstransplantation zur Behandlung von RPE und Netzhauterkrankungen verwendet 23,25,26,27,28,31,40. Dieser Ansatz ist in Studien an Nagetieren nicht nur für Zelltransplantations- und Gentherapieansätze, sondern auch für die Evaluierung n...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3% Tobramycin	Novartis	NDC  0078-0813-01	Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone	Novartis	NDC 0078-0876-01	Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0016-15	0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringe	Turemo	SS01T2713
1% Tropicamide	Alcon	NDC 0998-0355-15	1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0342-05	2.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plate	Costar	3526
30 G Disposable needle	Becton Dickinson (BD)	305128
33 G, 20 mm length blunt needles	Hamilton	7803-05
Automated Cell Counter	NanoEnTek	Model: Eve
B27 without Vitamin A	Life Technologies	12587001	2%36
Buprenorphine	Ceva		Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7	Sigma	C0742	5 µM36
Cyclosporine	Novartis		260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells	DUKE-NUS Medical School		Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
Gauze	Winner Industries Co. Ltd.	1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential Medium	Gibco	11710–035
hESC cell line H1	WiCell Research Institute	WA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02-50	10 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Prospec-Tany Technogene	CYT-272	10 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)	Ceva Santé Animale	KETALAB03
LN-521	Biolamina	LN521-02	1 µg36
mFreSR	STEMCELL Technologies	5854
Microlitre glass syringe (10 mL)	Hamilton	7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)	Selleckchem	S2215	10 µM36
N-2 supplement	Life Technologies	A13707-01	1%36
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140–050	1x36
NutriStem XF Media	Satorius	05-100-1A
Operating microscope	Zeiss	OPMI LUMERA 700	With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)	DUKE-NUS Medical School		See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
Pyruvate	Gibco	11360–070	1 mM36
Rd10 mice	Jackson Laboratory	B6.CXB1-Pde6brd10/J mice	Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g
Retinoic acid	Tocris Bioscience	0695/50	0.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)	Fisher Scientific	12-545-80
SB431542	Sigma	S4317	0.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)	Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)	Troy Laboratories	LI0605
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985–023	0.1 mM36