rd10小鼠中人胚胎干细胞衍生的光感受器祖细胞的视网膜下递送

摘要

我们描述了用于制备冷冻保存后 hESC 衍生的光感受器祖细胞以及这些细胞在 rd10 小鼠中的视网膜下递送的详细方案。

摘要

使用人类多能干细胞再生感光细胞是一种很有前途的疗法，可用于治疗晚期遗传性和衰老性视网膜疾病。我们已经证明，人类重组视网膜特异性层粘连蛋白亚型基质能够支持人胚胎干细胞（hESC）分化为光感受器祖细胞。此外，这些细胞的视网膜下注射在 rd10 啮齿动物和兔子模型中也显示出部分恢复。众所周知，视网膜下注射是一种既定的方法，由于它靠近目标空间，已被用于将药物化合物输送到眼睛的感光细胞和视网膜色素上皮 （RPE） 层。它还被用于将腺相关病毒载体输送到视网膜下空间以治疗视网膜疾病。由于小鼠眼球大小的限制，小鼠模型中药物化合物和细胞的视网膜下递送具有挑战性。该方案描述了用于注射的hESC衍生的光感受器祖细胞的详细程序以及这些细胞在遗传性视网膜色素变性突变 体rd10 小鼠中的视网膜下递送技术。这种方法允许对目标区域进行细胞治疗，特别是视网膜的外核层，在那里发生导致感光细胞变性的疾病。

引言

遗传性视网膜疾病和年龄相关性黄斑变性会导致感光细胞丢失并最终失明。视网膜感光器是视网膜的外段层，由负责光转导（即将光转换为神经元信号）的特殊细胞组成。视杆细胞和视锥细胞感光细胞与视网膜色素沉着层 （RPE^{） 相邻}1。补偿细胞损失的感光细胞替代疗法一直是一种新兴和发展中的治疗方法。胚胎干细胞 （ESC）^2、3、4、诱导多能干细胞 （iPSCs） 衍生的 RPE 细胞和视网膜祖细胞 （RPC）^{4、5、6、7、8} 用于恢复受损的感光细胞。视网膜下间隙是视网膜和 RPE 之间的密闭空间，是沉积这些细胞以替换受损的感光细胞、RPE 和 Mueller 细胞的有吸引力的位置，因为它位于附近 ^9,10,11....

研究方案

体内实验是根据新加坡保健集团（SingHealth）机构动物护理和使用委员会（IACUC）和视觉和眼科研究协会（ARVO）批准的关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明进行的。幼崽通过喂食含有环孢菌素（260 g/L）的饮用水，对幼崽进行从P17（移植前）到P30（移植后）的免疫抑制。

1. 冷冻保存后第 32 天 hESC 衍生的光感受器祖细胞的制备

1. 在37°C水浴中预热的光感受器分化培养基（PRDM）。
2. 从液氮中取出含有第 32 天 hESC 衍生的感光祖细胞的冷冻管。保持干冰。
3. 在37°C下在水浴中解冻冷冻管3-5分钟。将第 32 天细胞重悬于 1 mL PRDM 中，并以 130 x g 离心 4 分钟。
4. 除去上清液并将细胞重悬于 1 mL PRDM 中。
5. 取出 10 μL 混合物进行细胞计数。根据制造商的说明，使用 0.2% 台盼蓝混合细胞。将细胞混合物移液到细胞计数室载玻片中。通过自动细胞计数器确定细胞数量和活力。
6. 当细胞活力高于 70% 时继续下一步。将剩余的细胞悬液以130× g 离心4分钟。除去上清液，将细胞沉淀重悬于浓度为3×10⁵ 个细胞/μL的PRDM中用于移植。
7. 观察可见的细胞团块。使用微量离心管中的 10....

讨论

视网膜下注射已用于细胞悬浮移植，以治疗RPE和视网膜疾病23,25,26,27,28,31,40。这种方法在啮齿动物研究中非常重要，不仅对于细胞移植和基因治疗方法，而且对于评估视网膜疾病的新型治疗化合物也是如此。目前，有三种?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3% Tobramycin	Novartis	NDC  0078-0813-01	Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone	Novartis	NDC 0078-0876-01	Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0016-15	0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringe	Turemo	SS01T2713
1% Tropicamide	Alcon	NDC 0998-0355-15	1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0342-05	2.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plate	Costar	3526
30 G Disposable needle	Becton Dickinson (BD)	305128
33 G, 20 mm length blunt needles	Hamilton	7803-05
Automated Cell Counter	NanoEnTek	Model: Eve
B27 without Vitamin A	Life Technologies	12587001	2%36
Buprenorphine	Ceva		Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7	Sigma	C0742	5 µM36
Cyclosporine	Novartis		260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells	DUKE-NUS Medical School		Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
Gauze	Winner Industries Co. Ltd.	1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential Medium	Gibco	11710–035
hESC cell line H1	WiCell Research Institute	WA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02-50	10 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Prospec-Tany Technogene	CYT-272	10 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)	Ceva Santé Animale	KETALAB03
LN-521	Biolamina	LN521-02	1 µg36
mFreSR	STEMCELL Technologies	5854
Microlitre glass syringe (10 mL)	Hamilton	7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)	Selleckchem	S2215	10 µM36
N-2 supplement	Life Technologies	A13707-01	1%36
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140–050	1x36
NutriStem XF Media	Satorius	05-100-1A
Operating microscope	Zeiss	OPMI LUMERA 700	With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)	DUKE-NUS Medical School		See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
Pyruvate	Gibco	11360–070	1 mM36
Rd10 mice	Jackson Laboratory	B6.CXB1-Pde6brd10/J mice	Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g
Retinoic acid	Tocris Bioscience	0695/50	0.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)	Fisher Scientific	12-545-80
SB431542	Sigma	S4317	0.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)	Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)	Troy Laboratories	LI0605
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985–023	0.1 mM36