Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10

Riepilogo

Descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC post-crioconservate e la somministrazione sub-retinica di queste cellule in topi rd10 .

Abstract

La rigenerazione di cellule fotorecettrici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane è una terapia promettente per il trattamento di malattie retiniche ereditarie e di invecchiamento in fase avanzata. Abbiamo dimostrato che la matrice isoforme di laminina retina-specifica ricombinante umana è in grado di supportare la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in progenitori dei fotorecettori. Inoltre, l'iniezione sottoretinica di queste cellule ha anche mostrato un ripristino parziale nei modelli di roditore e coniglio rd10 . L'iniezione sottoretinica è nota per essere un metodo consolidato che è stato utilizzato per fornire composti farmaceutici alle cellule fotorecettrici e allo strato epiteliale pigmentato retinico (RPE) dell'occhio a causa della sua vicinanza allo spazio bersaglio. È stato anche utilizzato per fornire vettori virali adeno-associati nello spazio sottoretinico per trattare le malattie della retina. La somministrazione sottoretinica di composti farmaceutici e cellule nel modello murino è impegnativa a causa del vincolo delle dimensioni del bulbo oculare murino. Questo protocollo descrive la procedura dettagliata per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC per l'iniezione e la tecnica di somministrazione sottoretinica di queste cellule in topi mutanti genetici di retinite pigmentosa, rd10. Questo approccio consente la terapia cellulare nell'area bersaglio, in particolare lo strato nucleare esterno della retina, dove si verificano malattie che portano alla degenerazione dei fotorecettori.

Introduzione

Le malattie ereditarie della retina e la degenerazione maculare legata all'età portano alla perdita di cellule fotorecettrici e alla cecità. Il fotorecettore retinico è lo strato del segmento esterno della retina composto da cellule specializzate responsabili della fototrasduzione (cioè la conversione della luce in segnali neuronali). Le cellule fotorecettrici dei coni e dei bastoncelli sono adiacenti allo strato pigmentato retinico (RPE)¹. La terapia sostitutiva cellulare con fotorecettori per compensare la perdita cellulare è stato un approccio terapeutico emergente e in via di sviluppo. Le cellule staminali embrionali (^ESCs)^2,3,4, le cellule RPE derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) e le cellule progenitrici retiniche (RPC)^4,5,6,7,8 sono state utilizzate per ripristinare le cellule fotorecettrici danneggiate. Lo spazio sotto-retinico, uno spazio confinato tra la retina e l'RPE, è un luogo attraente per depositare queste cellule per sostituire le cellule fotorecettrici danneggiate, l'RPE e le cellule di Mueller a causa della sua vicinanza ^9,10,11.

Le terapie geniche e cellulari hanno utilizzato lo spazio sottoretinico per la medicina rigenerativa per varie malattie della retina in studi preclinici. Ciò include la consegna di copie funzionali del gene o degli strumenti di editing genetico sotto forma di terapia oligonucleotidica antisenso^12,13 o CRISPR/Cas9 o editing di base tramite la strategia basata su virus adeno-associati (AAV) 14,15,16, l'impianto di materiali (ad esempio, foglio RPE, protesi retiniche 17,18,19) e organoidi retinici derivati da cellule staminali differenziate ^20,21,22 per il trattamento delle malattie retiniche e correlate all'RPE. Studi clinici che utilizzano hESC-RPE³¹ nello spazio sottoretinico per il trattamento dell'amaurosi congenita di Leber (LCA) associata a RPE6523,24, acromatopsia legata a CNGA3²⁵, retinite pigmentosa associata a MERTK²⁶, coroideremia 27,28,29,30 si sono dimostrati efficaci. L'iniezione diretta di cellule in prossimità dell'area danneggiata migliora notevolmente la possibilità di insediamento cellulare nella regione appropriata, l'integrazione sinaptica e l'eventuale miglioramento visivo.

Anche se è stata stabilita l'iniezione sub-retinica in modelli umani e con occhi grandi (cioè maiale 32,33,34,35, coniglio 36,37,38,39,40 e primate non umano 41,42,43), tale iniezione nel modello murino è ancora impegnativa a causa del vincolo delle dimensioni del bulbo oculare e dell'enorme lente che occupa l'occhio del topo 44,45,46. Tuttavia, i modelli geneticamente modificati sono prontamente disponibili solo in piccoli animali e non in animali di grandi dimensioni (ad esempio, conigli e primati non umani), pertanto l'iniezione sottoretinica nei topi attira l'attenzione per studiare nuovi approcci terapeutici nelle malattie genetiche retiniche. Per veicolare cellule o AAV nello spazio sottoretinico vengono utilizzati tre approcci principali, vale a dire la via transcorneale, la via trans-sclerale e la via pars plana (vedere la Figura 2). Le vie transcorneali e transsclerali sono associate alla formazione di cataratta, alle sinechie, al sanguinamento coroideale e al reflusso dal sito di iniezione 11,44,45,47,48,49. Abbiamo adottato l'approccio pars plana come visualizzazione diretta del processo di iniezione e il sito di iniezione può essere raggiunto in tempo reale al microscopio.

Recentemente abbiamo descritto un metodo in grado di differenziare le cellule staminali embrionali umane (hESC) in progenitori fotorecettori in condizioni xenolibere, chimicamente definite, utilizzando l'isoforma di laminina ricombinante LN523 specifica per la retina umana. Poiché è stato scoperto che LN523 è presente nella retina, abbiamo ipotizzato che la nicchia della matrice extracellulare della retina umana potesse essere ricapitolata in vitro e quindi supportare la differenziazione dei fotorecettori dalle hESC³⁶. L'analisi trascrittomica a singola cellula ha mostrato che i progenitori dei fotorecettori che co-esprimono l'omeobox cono-bastoncino e la recoverina sono stati generati dopo 32 giorni. Un modello murino mutante di degenerazione retinica 10 (rd10) che imita la retinite pigmentosa umana autosomica è stato utilizzato per valutare l'efficacia dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC al giorno 32 in vivo. Le cellule progenitrici dei fotorecettori derivate da hESC sono state iniettate nello spazio sub-retinico di topi rd10 a P20, dove la disfunzione e la degenerazione dei fotocettori sono in corso³⁶. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC post-crioconservati e la consegna nello spazio sotto-retinico di topi rd10 . Questo metodo può essere utilizzato anche per somministrare AAV, sospensioni cellulari, peptidi o sostanze chimiche nello spazio sottoretinico nei topi.

Protocollo

Gli esperimenti in vivo sono stati condotti in conformità con le linee guida e il protocollo approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) e dalla Dichiarazione dell'Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e sulla visione. I cuccioli sono stati immunodepressi da P17 (pre-trapianto) a P30 (post-trapianto) nutrendoli con acqua potabile contenente ciclosporina (260 g/L).

1. Preparazione dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC del giorno 32 dopo crioconservazione

1. Mezzo di differenziazione dei fotorecettori preriscaldati (PRDM) in un bagno d'acqua a 37 °C.
2. Recupera dall'azoto liquido un crioviale contenente cellule progenitrici di fotorecettori derivate da hESC al giorno 32. Conservare con ghiaccio secco.
3. Scongelare il crioviale a 37 °C a bagnomaria per 3-5 minuti. Risospendere il giorno 32 cellule in 1 mL di PRDM e centrifugare a 130 x g per 4 min.
4. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di PRDM.
5. Rimuovere 10 μL della miscela per il conteggio delle cellule. Mescolare le celle utilizzando lo 0,2% di blu di tripano secondo le istruzioni del produttore. Pipettare la miscela di cellule nel vetrino della camera di conteggio delle cellule. Determina il numero di celle e la vitalità tramite il contatore automatico delle cellule.
6. Procedere al passaggio successivo quando la vitalità cellulare è superiore al 70%. Centrifugare la sospensione cellulare rimanente a 130 x g per 4 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in PRDM alla concentrazione di 3 x 10⁵ cellule/μL per il trapianto.
7. Osservare la presenza di grumi cellulari visibili. Risospendere ripetutamente i grumi di cellule utilizzando un puntale di pipetta da 10 μL nella provetta per microfuge fino a quando non si osserva alcun grumo di cellule visibile. Caricare nella siringa per iniezione 33G per osservare l'estrusione della soluzione cellulare attraverso l'ago.

2. Rilascio sottoretinico delle hESC nei topi rd10

1. Preparazione degli animali
   1. Anestetizzare il topo (P20, maschio/femmina, 3-6 g) utilizzando una combinazione di ketamina (20 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (2 mg/kg di peso corporeo) in una siringa di tubercolina da 1 mL collegata a un ago da 27G mediante approccio intraperitoneale. Somministrare un'iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,05 mg/kg) al topo come analgesico preventivo.
   2. Dopo aver somministrato l'anestesia, instillare una goccia ciascuna di tropicamide all'1% e fenilefrina al 2,5% per la dilatazione della pupilla. Applicare un gel oftalmico sulla cornea per prevenire la secchezza dell'occhio e la cataratta correlata all'anestesia.
   3. Metti il topo in una gabbia vuota fino a quando non sarà completamente anestetizzato. Valutare il corretto livello di anestetico pizzicando il cuscinetto della zampa e verificare se l'animale non reagisce al forte pizzicotto.
   4. Quando il topo è completamente anestetizzato, posizionare l'animale su un tappetino caldo a 38 °C.
2. Rilascio sottoretinico delle cellule
   1. Per utilizzare un approccio pars plana transvitreale a 1 porta, come fatto qui, eseguire l'iniezione sottoretinica in un ambiente sterile. Utilizzare un microscopio operativo verticale con un percorso di luce diretto per eseguire l'iniezione.
   2. Preparare la siringa di vetro da 10 μL rimuovendo il mozzo dell'ago. Montare l'ago smussato da 33G sulla siringa di vetro. Prenda il coperchio metallico del mozzo e fissi con cura l'ago sulla siringa.
   3. Sciacquare con acqua distillata per verificare la presenza di eventuali segni di perdite e pervietà dell'ago. Svuotare la siringa e metterla da parte con cura.
   4. Posizionare il topo anestetizzato su un cuscino, con l'occhio di trattamento rivolto verso l'alto verso l'obiettivo del microscopio. Applicare il cloridrato di proparacaina allo 0,5% e attendere 30 s. Applicare 150 μL di gel oftalmico sull'occhio e posizionare su di esso un vetrino coprioggetto rotondo.
   5. Eseguire un esame approssimativo dell'occhio osservando la cornea, l'iride, la pupilla, il cristallino e la congiuntiva. Attraverso la pupilla, visualizza il fondo oculare dell'occhio del topo regolando il piano focale. Regolare la testina fino a quando la testa ottica non è posizionata al centro della pupilla e ridurre al minimo il movimento della testa posizionandola correttamente sul cuscino.
   6. Picchiettare delicatamente la base del tubo con le hESC più volte per ottenere una sospensione cellulare uniforme. Utilizzando la siringa da microlitri di vetro da 10 μL con un ago smussato da 33 G, prelevare 2 μL di cellule/terreni. Prelevare le cellule subito prima dell'iniezione per evitare l'assestamento/aggregazione delle cellule nella siringa.
   7. Utilizzando un ago monouso da 30 G, praticare una ferita da sclerectomia 2 mm dietro il limbus. Mantenere l'angolo dell'ago a ~45° per evitare di toccare l'obiettivo. Una volta visualizzata la punta dell'ago nell'occhio, ritirare delicatamente l'ago. Gettare l'ago nel contenitore appuntito dopo l'uso per evitare lesioni da puntura dell'ago.
   8. Prendere la siringa di vetro e inserire l'ago smussato nella ferita della sclerectomia. Senza toccare la lente, far avanzare l'ago smussato fino a raggiungere la retina opposta alla ferita d'ingresso. Assicurarsi che l'area di iniezione sia libera dai principali vasi sanguigni della retina per evitare sanguinamento.
   9. Penetrare delicatamente nella retina fino a quando non si vede un ramo di pressione sulla sclera. Tenere l'estremità smussata dell'ago parallela alla sclera per evitare la fuoriuscita delle cellule nello spazio vitreo.
   10. Iniettare lentamente 2 μL di sospensione cellulare o terreno PRDM (controllo) nello spazio sottoretinico mantenendo una leggera pressione sulla siringa. Con un'iniezione riuscita, nel sito di iniezione deve formarsi una bolla visibile (cioè retina sollevata con la sospensione/terreno cellulare al suo interno).
       NOTA: Durante l'iniezione deve essere esercitata solo una leggera pressione per evitare la lacerazione della retina e il blocco delle cellule sulla punta dell'ago.
   11. Dopo aver confermato la bolla, attendere 10 secondi per lasciare che le cellule si stabilizzino. Ritrarre delicatamente l'ago dalla cruna di ritiro.
3. Tomografia a coerenza ottica (OCT) intraoperatoria del bleb (opzionale)
   1. Posiziona l'occhio del mouse per visualizzare il bollo sotto il microscopio muovendo lentamente la testa. Fissare la posizione tenendo delicatamente la testa. Non è necessaria alcuna dilatazione aggiuntiva della pupilla. Non rimuovere il vetrino coprioggetto e il gel sull'occhio. Fornisce un chiaro supporto ottico per visualizzare l'ebola.
   2. Eseguire l'OCT intraoperatorio utilizzando la funzione iOCT integrata del microscopio operatorio.
   3. Premere l'opzione Cubo nella schermata dello Strumento di personalizzazione di Office e posizionare l'area di scansione sul bleb premendo i pulsanti freccia . Regolare l'OCT facendo scorrere Centratura e Messa a fuoco per ottenere la migliore qualità OCT. Premere Acquisisci/Scansione per acquisire la scansione OCT dell'area bleb. Esaminare le immagini per verificare la qualità delle scansioni.
4. Guarigione
   1. Rimuovere il vetrino coprioggetto e pulire il gel dall'occhio con una garza. Applicare un unguento antibiotico una volta dopo l'iniezione per prevenire l'infezione.
   2. Lasciare che l'animale si riprenda dall'anestesia sotto una luce calda fino a quando non riacquista sufficiente coscienza per mantenere il decubito sternale e tornare alla gabbia di casa. Monitorare l'animale per almeno 3 giorni dopo l'iniezione per segni di infiammazione, infezione e angoscia.
      NOTA: La luce calda da 150 W deve trovarsi ad almeno 30 cm di distanza dalla gabbia dell'animale e prestare attenzione per evitare ustioni.
   3. Somministrare un'iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,05 mg/kg) 8 ore per 1 giorno o secondo le raccomandazioni del veterinario. Se si osserva un'infiammazione o un'infezione dell'occhio, consultare un veterinario per un trattamento appropriato.
5. Pulizia e sterilizzazione degli strumenti
   1. Sciacquare la siringa da microlitro di vetro da 10 μL e l'ago smussato da 33G con etanolo al 100% 10x. Lavare via l'etanolo facendo lampeggiare la siringa con acqua distillata.
   2. Smontare la siringa di vetro e l'ago. Asciugare la siringa per la conservazione.

Risultati

La siringa di vetro da 10 μL è stata assemblata secondo le istruzioni del produttore (Figura 1) e l'ago smussato utilizzato per erogare la sospensione/il terreno cellulare è mostrato nella Figura 1B. I diversi approcci per l'iniezione sottoretinica sono illustrati nella Figura 2. Descriviamo l'approccio pars plana in questo protocollo (Figura 2C). L'ago smussato montato su una siringa di vetro è sta...

Discussione

L'iniezione sottoretinica è stata utilizzata per il trapianto di sospensione cellulare per il trattamento di RPE e malattie retiniche 23,25,26,27,28,31,40. Questo approccio è molto essenziale negli studi sui roditori non solo per il trapianto di cellule e gli approcci di terapia genica, ma...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3% Tobramycin	Novartis	NDC  0078-0813-01	Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone	Novartis	NDC 0078-0876-01	Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0016-15	0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringe	Turemo	SS01T2713
1% Tropicamide	Alcon	NDC 0998-0355-15	1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0342-05	2.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plate	Costar	3526
30 G Disposable needle	Becton Dickinson (BD)	305128
33 G, 20 mm length blunt needles	Hamilton	7803-05
Automated Cell Counter	NanoEnTek	Model: Eve
B27 without Vitamin A	Life Technologies	12587001	2%36
Buprenorphine	Ceva		Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7	Sigma	C0742	5 µM36
Cyclosporine	Novartis		260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells	DUKE-NUS Medical School		Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
Gauze	Winner Industries Co. Ltd.	1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential Medium	Gibco	11710–035
hESC cell line H1	WiCell Research Institute	WA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02-50	10 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Prospec-Tany Technogene	CYT-272	10 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)	Ceva Santé Animale	KETALAB03
LN-521	Biolamina	LN521-02	1 µg36
mFreSR	STEMCELL Technologies	5854
Microlitre glass syringe (10 mL)	Hamilton	7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)	Selleckchem	S2215	10 µM36
N-2 supplement	Life Technologies	A13707-01	1%36
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140–050	1x36
NutriStem XF Media	Satorius	05-100-1A
Operating microscope	Zeiss	OPMI LUMERA 700	With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)	DUKE-NUS Medical School		See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
Pyruvate	Gibco	11360–070	1 mM36
Rd10 mice	Jackson Laboratory	B6.CXB1-Pde6brd10/J mice	Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g
Retinoic acid	Tocris Bioscience	0695/50	0.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)	Fisher Scientific	12-545-80
SB431542	Sigma	S4317	0.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)	Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)	Troy Laboratories	LI0605
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985–023	0.1 mM36