Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10

Riepilogo

Descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC post-crioconservate e la somministrazione sub-retinica di queste cellule in topi rd10 .

Abstract

La rigenerazione di cellule fotorecettrici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane è una terapia promettente per il trattamento di malattie retiniche ereditarie e di invecchiamento in fase avanzata. Abbiamo dimostrato che la matrice isoforme di laminina retina-specifica ricombinante umana è in grado di supportare la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in progenitori dei fotorecettori. Inoltre, l'iniezione sottoretinica di queste cellule ha anche mostrato un ripristino parziale nei modelli di roditore e coniglio rd10 . L'iniezione sottoretinica è nota per essere un metodo consolidato che è stato utilizzato per fornire composti farmaceutici alle cellule fotorecettrici e allo strato epiteliale pigmentato retinico (RPE) dell'occhio a causa della sua vicinanza allo spazio bersaglio. È stato anche utilizzato per fornire vettori virali adeno-associati nello spazio sottoretinico per trattare le malattie della retina. La somministrazione sottoretinica di composti farmaceutici e cellule nel modello murino è impegnativa a causa del vincolo delle dimensioni del bulbo oculare murino. Questo protocollo descrive la procedura dettagliata per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC per l'iniezione e la tecnica di somministrazione sottoretinica di queste cellule in topi mutanti genetici di retinite pigmentosa, rd10. Questo approccio consente la terapia cellulare nell'area bersaglio, in particolare lo strato nucleare esterno della retina, dove si verificano malattie che portano alla degenerazione dei fotorecettori.

Introduzione

Le malattie ereditarie della retina e la degenerazione maculare legata all'età portano alla perdita di cellule fotorecettrici e alla cecità. Il fotorecettore retinico è lo strato del segmento esterno della retina composto da cellule specializzate responsabili della fototrasduzione (cioè la conversione della luce in segnali neuronali). Le cellule fotorecettrici dei coni e dei bastoncelli sono adiacenti allo strato pigmentato retinico (RPE)¹. La terapia sostitutiva cellulare con fotorecettori per compensare la perdita cellulare è stato un approccio terapeutico emergente e in via di sviluppo. Le cellule staminali embrionali (^ESCs....

Protocollo

Gli esperimenti in vivo sono stati condotti in conformità con le linee guida e il protocollo approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) e dalla Dichiarazione dell'Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e sulla visione. I cuccioli sono stati immunodepressi da P17 (pre-trapianto) a P30 (post-trapianto) nutrendoli con acqua potabile contenente ciclosporina (260 g/L).

1. Preparazione dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC del giorno 32 dopo crioconservazione

1. Mezzo di differenziazione dei fotorec....

Discussione

L'iniezione sottoretinica è stata utilizzata per il trapianto di sospensione cellulare per il trattamento di RPE e malattie retiniche 23,25,26,27,28,31,40. Questo approccio è molto essenziale negli studi sui roditori non solo per il trapianto di cellule e gli approcci di terapia genica, ma.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3% Tobramycin	Novartis	NDC  0078-0813-01	Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone	Novartis	NDC 0078-0876-01	Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0016-15	0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringe	Turemo	SS01T2713
1% Tropicamide	Alcon	NDC 0998-0355-15	1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0342-05	2.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plate	Costar	3526
30 G Disposable needle	Becton Dickinson (BD)	305128
33 G, 20 mm length blunt needles	Hamilton	7803-05
Automated Cell Counter	NanoEnTek	Model: Eve
B27 without Vitamin A	Life Technologies	12587001	2%36
Buprenorphine	Ceva		Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7	Sigma	C0742	5 µM36
Cyclosporine	Novartis		260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells	DUKE-NUS Medical School		Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
Gauze	Winner Industries Co. Ltd.	1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential Medium	Gibco	11710–035
hESC cell line H1	WiCell Research Institute	WA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02-50	10 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Prospec-Tany Technogene	CYT-272	10 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)	Ceva Santé Animale	KETALAB03
LN-521	Biolamina	LN521-02	1 µg36
mFreSR	STEMCELL Technologies	5854
Microlitre glass syringe (10 mL)	Hamilton	7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)	Selleckchem	S2215	10 µM36
N-2 supplement	Life Technologies	A13707-01	1%36
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140–050	1x36
NutriStem XF Media	Satorius	05-100-1A
Operating microscope	Zeiss	OPMI LUMERA 700	With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)	DUKE-NUS Medical School		See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
Pyruvate	Gibco	11360–070	1 mM36
Rd10 mice	Jackson Laboratory	B6.CXB1-Pde6brd10/J mice	Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g
Retinoic acid	Tocris Bioscience	0695/50	0.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)	Fisher Scientific	12-545-80
SB431542	Sigma	S4317	0.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)	Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)	Troy Laboratories	LI0605
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985–023	0.1 mM36