Entrega sub-retiniana de progenitores fotorreceptores derivados de células madre embrionarias humanas en ratones rd10

Resumen

Describimos un protocolo detallado para la preparación de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC post-criopreservadas y la administración sub-retiniana de estas células en ratones rd10 .

Resumen

La regeneración de células fotorreceptoras utilizando células madre pluripotentes humanas es una terapia prometedora para el tratamiento de enfermedades de la retina hereditarias y de envejecimiento en etapas avanzadas. Hemos demostrado que la matriz de isoformas de laminina específica de retina recombinante humana es capaz de apoyar la diferenciación de células madre embrionarias humanas (hESCs) a progenitores de fotorreceptores. Además, la inyección sub-retiniana de estas células también ha mostrado una restauración parcial en los modelos de roedores y conejos rd10 . Se sabe que la inyección subretiniana es un método establecido que se ha utilizado para administrar compuestos farmacéuticos a las células fotorreceptoras y a la capa epitelial pigmentada de la retina (EPR) del ojo debido a su proximidad al espacio objetivo. También se ha utilizado para administrar vectores virales adenoasociados en el espacio subretiniano para tratar enfermedades de la retina. La administración sub-retiniana de compuestos farmacéuticos y células en el modelo murino es un desafío debido a la restricción en el tamaño del globo ocular murino. Este protocolo describe el procedimiento detallado para la preparación de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC para inyección y la técnica de administración sub-retiniana de estas células en ratones con mutación de retinosis pigmentaria genética, rd10 . Este enfoque permite la terapia celular en el área objetivo, en particular la capa nuclear externa de la retina, donde se producen las enfermedades que conducen a la degeneración de los fotorreceptores.

Introducción

Las enfermedades hereditarias de la retina y la degeneración macular relacionada con la edad conducen a la pérdida de células fotorreceptoras y a la ceguera final. El fotorreceptor de la retina es la capa del segmento externo de la retina compuesta por células especializadas responsables de la fototransducción (es decir, la conversión de la luz en señales neuronales). Los bastones y los conos fotorreceptores se encuentran adyacentes a la capa pigmentada de la retina (EPR)¹. La terapia de reemplazo de células fotorreceptoras para compensar la pérdida celular ha sido un enfoque terapéutico emergente y en desarrollo. Se utilizaron células madre embrionarias (ESC)^2,3,4, células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de células madre y células progenitoras de la retina (RPC)4,5,6,7,8 para restaurar las células fotorreceptoras dañadas. El espacio sub-retiniano, un espacio confinado entre la retina y el EPR, es un lugar atractivo para depositar estas células para reemplazar las células fotorreceptoras dañadas, el EPR y las células de Mueller debido a su proximidad ^9,10,11.

Las terapias génicas y celulares han estado utilizando el espacio sub-retiniano para la medicina regenerativa para diversas enfermedades de la retina en estudios preclínicos. Esto incluye la administración de copias funcionales del gen o de las herramientas de edición génica en forma de terapia con oligonucleótidos antisentido^12,13 o CRISPR/Cas9 o la edición de bases a través de una estrategia basada en virus adenoasociados (AAV) 14,15,16, la implantación de materiales (p. ej., lámina de EPR, prótesis retinianas 17,18,19) y organoides retinianos diferenciados derivados de células madre ^20,21,22 para tratar enfermedades relacionadas con la retina y el EPR. Ensayos clínicos que utilizan hESC-RPE³¹ en el espacio subretiniano para tratar la amaurosis congénita de Leber (LCA) asociada a RPE6523,24, la acromatopsia ligada a CNGA3²⁵, la retinosis pigmentaria asociada a MERTK²⁶, la coroideremia 27,28,29,30 han demostrado ser un enfoque eficaz. La inyección directa de células en las proximidades del área dañada mejora en gran medida la posibilidad de asentamiento celular en la región apropiada, la integración sináptica y la eventual mejoría visual.

A pesar de que se ha establecido la inyección sub-retiniana en modelos humanos y de ojos grandes (es decir, cerdo 32,33,34,35, conejo 36,37,38,39,40 y primates no humanos 41,42,43), dicha inyección en el modelo murino sigue siendo un desafío debido a la limitación del tamaño del globo ocular y al enorme tamaño del globo ocular. lente que ocupa el ojo del ratón 44,45,46. Sin embargo, los modelos modificados genéticamente solo están disponibles en animales pequeños y no en animales grandes (es decir, conejos y primates no humanos), por lo que la inyección subrretiniana en ratones llama la atención para investigar nuevos enfoques terapéuticos en trastornos genéticos de la retina. Se están utilizando tres enfoques principales para administrar células o AAV en el espacio subretiniano, a saber, la ruta transcorneal, la ruta transescleral y la ruta pars plana (ver Figura 2). Las vías transcorneales y transesclerales se asocian con la formación de cataratas, sinequias, hemorragia coroidea y reflujo desde el lugar de la inyección 11,44,45,47,48,49. Adoptamos el enfoque de pars plana como una visualización directa del proceso de inyección, y el sitio de inyección se puede lograr en tiempo real bajo el microscopio.

Recientemente describimos un método que puede diferenciar células madre embrionarias humanas (hESCs) en progenitores de fotorreceptores bajo condiciones químicamente definidas y libres de xenos utilizando la isoforma de laminina recombinante específica de retina humana LN523. Dado que se encontró que LN523 estaba presente en la retina, planteamos la hipótesis de que el nicho de la matriz extracelular de la retina humana podría recapitularse in vitro y, por lo tanto, apoyar la diferenciación de los fotorreceptores de las hESC³⁶. El análisis transcriptómico de una sola célula mostró que los progenitores fotorreceptores que coexpresan la homeobox de conos y la recoverina se generaron después de 32 días. Se utilizó un modelo de ratón mutante de degeneración retiniana 10 (rd10) que imita la retinosis pigmentaria humana autosómica para evaluar la eficacia de los progenitores fotorreceptores derivados de hESC de día 32 in vivo. Las células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC se inyectaron en el espacio sub-retiniano de ratones rd10 en P20, donde la disfunción y degeneración de los fotoceptores están en curso³⁶. Aquí, describimos un protocolo detallado para la preparación de los progenitores de fotorreceptores derivados de hESC post-criopreservados y la administración en el espacio sub-retiniano de ratones rd10 . Este método también se puede utilizar para administrar AAV, suspensiones celulares, péptidos o productos químicos en el espacio subretiniano en ratones.

Protocolo

Los experimentos in vivo se realizaron de acuerdo con las pautas y el protocolo aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de SingHealth (IACUC) y la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión. Las crías fueron inmunosuprimidas desde P17 (pre-trasplante) hasta P30 (post-trasplante) alimentándolas con agua potable que contenía ciclosporina (260 g/L).

1. Preparación de progenitores fotorreceptores derivados de hESC de día 32 después de la criopreservación

1. Medio de diferenciación fotorreceptor precalentado (PRDM) en un baño de agua a 37 °C.
2. Recuperar un criovial que contiene células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC de día 32 a partir de nitrógeno líquido. Manténgalo en hielo seco.
3. Descongelar la criovial a 37 °C al baño maría durante 3-5 min. Resuspender las 32 células del día en 1 mL de PRDM y centrifugar a 130 x g durante 4 min.
4. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 mL de PRDM.
5. Retire 10 μL de la mezcla para el recuento de células. Mezcle las células con azul de tripano al 0,2% de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Pipetee la mezcla de células en el portaobjetos de la cámara de recuento de células. Determine el número de celdas y la viabilidad mediante un contador de celdas automatizado.
6. Continúe con el siguiente paso cuando la viabilidad de la célula sea superior al 70%. Centrifugar la suspensión celular restante a 130 x g durante 4 min. Retirar el sobrenadante y resuspender el gránulo celular en PRDM a la concentración de 3 x 10⁵ células/μL para trasplante.
7. Observe si hay grupos celulares visibles. Vuelva a suspender los grupos celulares repetidamente utilizando una punta de pipeta de 10 μL en el tubo de microfuga hasta que no se observe ningún grupo celular visible. Cargue en la jeringa de inyección 33G para observar la extrusión de la solución celular a través de la aguja.

2. Liberación sub-retiniana de las hESCs en ratones rd10

1. Preparación de los animales
   1. Anestesiar al ratón (P20, macho/hembra, 3-6 g) utilizando una combinación de ketamina (20 mg/kg de peso corporal) y xilacina (2 mg/kg de peso corporal) en una jeringa de tuberculina de 1 ml unida a una aguja de 27G por vía intraperitoneal. Administrar una inyección subcutánea de buprenorfina (0,05 mg/kg) al ratón como analgésico preventivo.
   2. Después de administrar la anestesia, instilar una gota de tropicamida al 1% y fenilefrina al 2,5% para la dilatación de la pupila. Aplique un gel oftálmico en la córnea para evitar que el ojo se seque y las cataratas relacionadas con la anestesia.
   3. Coloque al ratón en una jaula vacía hasta que esté completamente anestesiado. Evalúe el nivel adecuado de anestesia pellizcando la almohadilla de la pata y confirme si el animal no reacciona al pellizco fuerte.
   4. Cuando el ratón esté completamente anestesiado, coloque al animal sobre una almohadilla tibia colocada a 38 °C.
2. Liberación sub-retiniana de las células
   1. Para utilizar un abordaje de pars plana transvítrea de 1 puerto, como se hace aquí, realice la inyección subretiniana en un entorno estéril. Utilice un microscopio de operación vertical con una trayectoria de luz directa para realizar la inyección.
   2. Prepare la jeringa de vidrio de 10 μL retirando el cubo de la aguja. Monte la aguja roma 33G en la jeringa de vidrio. Tome la cubierta metálica del cubo y asegure con cuidado la aguja en la jeringa.
   3. Enjuague con agua destilada para verificar si hay signos de fugas y permeabilidad de la aguja. Vacíe la jeringa y colóquela a un lado con cuidado.
   4. Coloque el ratón anestesiado sobre una almohada, con el ojo de tratamiento mirando hacia arriba directamente hacia el objetivo del microscopio. Aplicar el clorhidrato de proparacaína al 0,5% y esperar 30 s. Aplicar 150 μL de gel oftálmico sobre el ojo y colocar sobre él un cubreobjetos redondo.
   5. Realice un examen aproximado del ojo observando la córnea, el iris, la pupila, el cristalino y la conjuntiva. A través de la pupila, visualiza el fondo del ojo del ratón ajustando el plano focal. Ajuste la cabeza hasta que la cabeza óptica se coloque en el centro de la pupila y minimice el movimiento de la cabeza colocándola correctamente sobre la almohada.
   6. Golpee suavemente la base del tubo con las hESC varias veces para obtener una suspensión celular uniforme. Utilizando la jeringa de microlitros de vidrio de 10 μL con una aguja roma de 33G, extraiga 2 μL de células/medios. Extraiga las células justo antes de la inyección para evitar que las células se asienten o se aglutinen en la jeringa.
   7. Con una aguja desechable de 30 G, haga una herida de esclerectomía a 2 mm detrás del limbo. Mantenga el ángulo de la aguja a ~45° para evitar tocar la lente. Una vez que se visualice la punta de la aguja en el ojo, retire suavemente la aguja. Deseche la aguja en el recipiente afilado después de usarla para evitar lesiones por pinchazos con la aguja.
   8. Tome la jeringa de vidrio e inserte la aguja roma en la herida de la esclerectomía. Sin tocar el cristalino, avance la aguja roma hasta que llegue a la retina opuesta de la herida de entrada. Asegúrese de que el área de la inyección esté libre de los principales vasos sanguíneos de la retina para evitar sangrado.
   9. Penetre suavemente en la retina hasta que se vea una rama de presión en la esclerótica. Mantenga el extremo romo de la aguja paralelo a la esclerótica para evitar la fuga de las células hacia el espacio vítreo.
   10. Inyecte lentamente 2 μL de suspensión celular o medio PRDM (control) en el espacio subretiniano mientras se mantiene una presión suave sobre la jeringa. Con una inyección exitosa, se debe formar una ampolla visible (es decir, una retina elevada con la suspensión/medio celular en ella) en el lugar de la inyección.
       NOTA: Solo se debe usar una presión suave durante la inyección para evitar el desgarro de la retina y el bloqueo de las células en la punta de la aguja.
   11. Después de confirmar la ampolla, espere 10 segundos para que las células se asienten. Retraiga suavemente la aguja del ojo.
3. Tomografía de coherencia óptica (OCT) intraoperatoria de la ampolla (opcional)
   1. Coloque el ojo del ratón para visualizar la ampolla bajo el microscopio moviendo lentamente la cabeza. Asegure la posición sujetando suavemente la cabeza. No es necesaria una dilatación adicional de la pupila. No retire el cubreobjetos y el gel del ojo. Proporciona un medio óptico claro para visualizar la ampolla.
   2. Realice la OCT intraoperatoria utilizando la función iOCT incorporada del microscopio quirúrgico.
   3. Presione la opción Cubo en la pantalla OCT y coloque el área de escaneo en la ampolla presionando los botones de flecha . Ajuste la OCT deslizando el centrado y el enfoque para obtener la mejor calidad de OCT. Presione Capturar/Escanear para adquirir el escaneo OCT del área de la ampolla. Revise las imágenes para comprobar la calidad de los escaneos.
4. Recuperación
   1. Retire el cubreobjetos y limpie el gel del ojo con una gasa. Aplique ungüento antibiótico una vez después de la inyección para prevenir infecciones.
   2. Permita que el animal se recupere de la anestesia bajo una luz cálida hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal y regresar a la jaula de origen. Vigile al animal durante al menos 3 días después de la inyección para detectar signos de inflamación, infección y angustia.
      NOTA: La luz cálida de 150 W debe estar al menos a 30 cm de distancia de la jaula del animal, y se debe tener precaución para evitar una lesión por quemadura.
   3. Administrar una inyección subcutánea de buprenorfina (0,05 mg/kg) 8 horas durante 1 día o según recomendación del veterinario. Si se observa inflamación o infección del ojo, consulte a un profesional veterinario para el tratamiento adecuado.
5. Limpieza y esterilización del instrumental
   1. Enjuague la jeringa de microlitros de vidrio de 10 μL y la aguja roma de 33G con etanol al 100% 10x. Lave el etanol flasheando la jeringa con agua destilada.
   2. Desmonte la jeringa de vidrio y la aguja. Seque la jeringa para guardarla.

Resultados

La jeringa de vidrio de 10 μL se ensambló de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 1), y la aguja roma utilizada para administrar la suspensión/medio celular se muestra en la Figura 1B. En la Figura 2 se ilustran diferentes enfoques para la inyección subretiniana. Describimos el enfoque de pars plana en este protocolo (Figura 2C). La aguja roma montada en una jeringa de vidrio se inse...

Discusión

La inyección subretiniana se ha utilizado para el trasplante en suspensión celular para tratar el EPR y las enfermedades de la retina 23,25,26,27,28,31,40. Este enfoque es muy esencial en los estudios con roedores, no solo para el trasplante de células y los enfoques de terapia génica, s...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3% Tobramycin	Novartis	NDC  0078-0813-01	Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone	Novartis	NDC 0078-0876-01	Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0016-15	0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringe	Turemo	SS01T2713
1% Tropicamide	Alcon	NDC 0998-0355-15	1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0342-05	2.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plate	Costar	3526
30 G Disposable needle	Becton Dickinson (BD)	305128
33 G, 20 mm length blunt needles	Hamilton	7803-05
Automated Cell Counter	NanoEnTek	Model: Eve
B27 without Vitamin A	Life Technologies	12587001	2%36
Buprenorphine	Ceva		Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7	Sigma	C0742	5 µM36
Cyclosporine	Novartis		260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells	DUKE-NUS Medical School		Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
Gauze	Winner Industries Co. Ltd.	1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential Medium	Gibco	11710–035
hESC cell line H1	WiCell Research Institute	WA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02-50	10 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Prospec-Tany Technogene	CYT-272	10 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)	Ceva Santé Animale	KETALAB03
LN-521	Biolamina	LN521-02	1 µg36
mFreSR	STEMCELL Technologies	5854
Microlitre glass syringe (10 mL)	Hamilton	7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)	Selleckchem	S2215	10 µM36
N-2 supplement	Life Technologies	A13707-01	1%36
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140–050	1x36
NutriStem XF Media	Satorius	05-100-1A
Operating microscope	Zeiss	OPMI LUMERA 700	With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)	DUKE-NUS Medical School		See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
Pyruvate	Gibco	11360–070	1 mM36
Rd10 mice	Jackson Laboratory	B6.CXB1-Pde6brd10/J mice	Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g
Retinoic acid	Tocris Bioscience	0695/50	0.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)	Fisher Scientific	12-545-80
SB431542	Sigma	S4317	0.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)	Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)	Troy Laboratories	LI0605
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985–023	0.1 mM36