Entrega sub-retiniana de progenitores fotorreceptores derivados de células madre embrionarias humanas en ratones rd10

Resumen

Describimos un protocolo detallado para la preparación de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC post-criopreservadas y la administración sub-retiniana de estas células en ratones rd10 .

Resumen

La regeneración de células fotorreceptoras utilizando células madre pluripotentes humanas es una terapia prometedora para el tratamiento de enfermedades de la retina hereditarias y de envejecimiento en etapas avanzadas. Hemos demostrado que la matriz de isoformas de laminina específica de retina recombinante humana es capaz de apoyar la diferenciación de células madre embrionarias humanas (hESCs) a progenitores de fotorreceptores. Además, la inyección sub-retiniana de estas células también ha mostrado una restauración parcial en los modelos de roedores y conejos rd10 . Se sabe que la inyección subretiniana es un método establecido que se ha utilizado para administrar compuestos farmacéuticos a las células fotorreceptoras y a la capa epitelial pigmentada de la retina (EPR) del ojo debido a su proximidad al espacio objetivo. También se ha utilizado para administrar vectores virales adenoasociados en el espacio subretiniano para tratar enfermedades de la retina. La administración sub-retiniana de compuestos farmacéuticos y células en el modelo murino es un desafío debido a la restricción en el tamaño del globo ocular murino. Este protocolo describe el procedimiento detallado para la preparación de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC para inyección y la técnica de administración sub-retiniana de estas células en ratones con mutación de retinosis pigmentaria genética, rd10 . Este enfoque permite la terapia celular en el área objetivo, en particular la capa nuclear externa de la retina, donde se producen las enfermedades que conducen a la degeneración de los fotorreceptores.

Introducción

Las enfermedades hereditarias de la retina y la degeneración macular relacionada con la edad conducen a la pérdida de células fotorreceptoras y a la ceguera final. El fotorreceptor de la retina es la capa del segmento externo de la retina compuesta por células especializadas responsables de la fototransducción (es decir, la conversión de la luz en señales neuronales). Los bastones y los conos fotorreceptores se encuentran adyacentes a la capa pigmentada de la retina (EPR)¹. La terapia de reemplazo de células fotorreceptoras para compensar la pérdida celular ha sido un enfoque terapéutico emergente y en desarrollo. Se utilizaron células madre em....

Protocolo

Los experimentos in vivo se realizaron de acuerdo con las pautas y el protocolo aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de SingHealth (IACUC) y la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión. Las crías fueron inmunosuprimidas desde P17 (pre-trasplante) hasta P30 (post-trasplante) alimentándolas con agua potable que contenía ciclosporina (260 g/L).

1. Preparación de progenitores fotorreceptores derivados de hESC de día 32 después de la criopreservación

1. Medio de diferenciaci....

Discusión

La inyección subretiniana se ha utilizado para el trasplante en suspensión celular para tratar el EPR y las enfermedades de la retina 23,25,26,27,28,31,40. Este enfoque es muy esencial en los estudios con roedores, no solo para el trasplante de células y los enfoques de terapia génica, s.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3% Tobramycin	Novartis	NDC  0078-0813-01	Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone	Novartis	NDC 0078-0876-01	Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0016-15	0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringe	Turemo	SS01T2713
1% Tropicamide	Alcon	NDC 0998-0355-15	1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0342-05	2.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plate	Costar	3526
30 G Disposable needle	Becton Dickinson (BD)	305128
33 G, 20 mm length blunt needles	Hamilton	7803-05
Automated Cell Counter	NanoEnTek	Model: Eve
B27 without Vitamin A	Life Technologies	12587001	2%36
Buprenorphine	Ceva		Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7	Sigma	C0742	5 µM36
Cyclosporine	Novartis		260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells	DUKE-NUS Medical School		Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
Gauze	Winner Industries Co. Ltd.	1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential Medium	Gibco	11710–035
hESC cell line H1	WiCell Research Institute	WA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02-50	10 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Prospec-Tany Technogene	CYT-272	10 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)	Ceva Santé Animale	KETALAB03
LN-521	Biolamina	LN521-02	1 µg36
mFreSR	STEMCELL Technologies	5854
Microlitre glass syringe (10 mL)	Hamilton	7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)	Selleckchem	S2215	10 µM36
N-2 supplement	Life Technologies	A13707-01	1%36
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140–050	1x36
NutriStem XF Media	Satorius	05-100-1A
Operating microscope	Zeiss	OPMI LUMERA 700	With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)	DUKE-NUS Medical School		See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
Pyruvate	Gibco	11360–070	1 mM36
Rd10 mice	Jackson Laboratory	B6.CXB1-Pde6brd10/J mice	Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g
Retinoic acid	Tocris Bioscience	0695/50	0.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)	Fisher Scientific	12-545-80
SB431542	Sigma	S4317	0.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)	Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)	Troy Laboratories	LI0605
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985–023	0.1 mM36