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요약

동결 보존 후 hESC 유래 광수용체 전구 세포의 제조 및 rd10 마우스에서 이러한 세포의 망막하 전달에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

초록

인간 만능 줄기세포를 이용한 광수용체 세포의 재생은 진행된 단계의 유전성 및 노화 망막 질환 치료에 유망한 치료법입니다. 우리는 인간 재조합 망막 특이적 라미닌 동형 매트릭스가 인간 배아 줄기 세포(hESC)에서 광수용체 전구세포로의 분화를 지원할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, 이들 세포의 망막하 주사는 rd10 설치류 및 토끼 모델에서도 부분적인 회복을 보여주었다. 망막하 주사는 표적 공간과의 근접성으로 인해 눈의 광수용체 세포와 망막 색소 상피(RPE)층에 제약 화합물을 전달하는 데 사용되는 확립된 방법으로 알려져 있습니다. 또한 망막 질환을 치료하기 위해 아데노 관련 바이러스 벡터를 망막 하 공간으로 전달하는 데 사용되었습니다. 쥐 모델에서 제약 화합물 및 세포의 망막하 전달은 쥐 안구 크기의 제약으로 인해 어렵습니다. 이 프로토콜은 유전성 망막염 색소성 돌연변이, rd10 마우스에서 주입을 위한 hESC 유래 광수용체 전구 세포의 제조와 이들 세포의 망막하 전달 기술에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 이 접근법은 표적 부위, 특히 광수용체 변성으로 이어지는 질병이 발생하는 망막의 외부 핵층에 대한 세포 치료를 가능하게 합니다.

서문

유전성 망막 질환과 노화 관련 황반 변성은 광수용체 세포 손실과 결국 실명으로 이어집니다. 망막 광수용체(retinal photoreceptor)는 광전달(즉, 빛을 신경 신호로 변환)을 담당하는 특수 세포로 구성된 망막의 바깥쪽 분절 층입니다. 간상체와 원추세포 광수용체 세포는 망막 색소층(RPE)에 인접해 있습니다1. 세포 손실을 보상하기 위한 광수용체 세포 대체 요법은 새롭게 발전하고 있는 치료 접근법입니다. 손상된 광수용체 세포를 복원하기 위해 배아 줄기 세포(ESC)2,3,4, 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 RPE 세포 및 망막 전구 세포(RPC)4,5,6,7,8을 사용했습니다. 망막과 RPE 사이의 제한된 공간인 망막하 공간은 손상된 광수용체 세포, RPE 및 Mueller 세포를 대체하기 위해 이러한 세포를 증착하기에 매력적인 위치입니다 9,10,11.

유전자 및 세포 치료제는 전임상 연구에서 다양한 망막 질환에 대한 재생 의학을 위해 망막 하부 공간을 활용하고 있습니다. 여기에는 안티-센스 올리고뉴클레오티드 요법(anti-sense oligonucleotide therapy)12,13 또는 CRISPR/Cas9 또는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 기반 전략(14,15,16)을 통한 염기 편집(base editing)의 형태로 유전자 또는 유전자 편집 도구의 기능적 사본 전달(functional copy)의 전달이 포함되며, 물질(예: RPE 시트, 망막 보철물 17,18,19) 및 분화된 줄기세포 유래 망막 오가노이드(differentiated stem-cell-derived retinal organoid)20,21,22 망막 및 RPE 관련 질환을 치료합니다. RPE65 관련 Leber 선천성 무뇨증(LCA)23,24, CNGA3 관련 색소 침착증25, MERTK 관련 색소성 망막염26, 맥락막혈증 27,28,29,30을 치료하기 위해 망막하 공간에서 hESC-RPE 31을 사용한 임상 시험 효과적인 접근 방식임이 입증되었습니다. 손상된 부위 부근에 세포를 직접 주입하면 해당 부위에 세포가 정착하고 시냅스가 통합되며 궁극적으로 시력이 개선될 가능성이 크게 향상됩니다.

인간 및 큰 눈을 가진 모델(즉, 돼지 32,33,34,35, 토끼 36,37,38,39,40 및 비인간 영장류 41,42,43)에서 망막하 주사가 확립되었지만, 쥐 모델에서의 이러한 주입은 안구 크기의 제약과 거대함으로 인해 여전히 어렵습니다 마우스 눈(44,45,46)을 차지하는 렌즈. 그러나 유전자 변형 모델은 작은 동물에서만 쉽게 사용할 수 있고 큰 동물(즉, 토끼 및 인간이 아닌 영장류)에서는 쉽게 사용할 수 없기 때문에 마우스의 망막하 주사는 망막 유전 질환에 대한 새로운 치료 접근법을 조사하는 데 주목을 받고 있습니다. 세포 또는 AAV를 망막하 공간으로 전달하기 위해 세 가지 주요 접근 방식, 즉 각막 횡단 경로, 공막 횡단 경로 및 파스 플라나 경로가 사용됩니다(그림 2 참조). 경각막 및 경공막 경로는 백내장 형성, synechiae, 맥락막 출혈 및 주사 부위의 역류와 관련이 있습니다 11,44,45,47,48,49. 우리는 주입 공정의 직접적인 시각화로 pars plana 접근 방식을 채택했으며 현미경으로 실시간으로 주입 부위를 얻을 수 있습니다.

우리는 최근 재조합 인간 망막 특이적 라미닌 동형 LN523을 사용하여 화학적으로 정의된 이종 없는 조건에서 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 광수용체 전구세포로 분화할 수 있는 방법을 설명했습니다. LN523이 망막에 존재하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 우리는 인간 망막의 세포외 기질 틈새가 시험관 내에서 재현될 수 있고, 따라서 hESCs로부터 광수용체 분화를 지원할 수 있다는 가설을 세웠다36. 단세포 전사체 분석 결과, 32일 후 cone-rod homeobox와 recoverin을 함께 발현하는 광수용체 전구세포가 생성되었습니다. 상염색체 인간 색소성 망막염을 모방한 망막 변성 10(rd10) 돌연변이 마우스 모델을 사용하여 생체 내 32 hESC 유래 광수용체 전구체의 효능을 평가했습니다. hESC 유래 광수용체 전구세포를 광수용체 기능 장애 및 퇴화가 진행 중인 P20에서 rd10 마우스의 망막하 공간에 주입하였다36. 여기에서는 동결 후 보존된 hESC 유래 광수용체 전구체의 준비 및 rd10 마우스의 망막하 공간으로의 전달을 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 또한 마우스의 망막하 공간에 AAV, 세포 현탁액, 펩타이드 또는 화학물질을 투여하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

생체 내 실험은 SingHealth의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 및 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology) 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 지침과 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 새끼들은 사이클로스포린(260g/L)이 함유된 식수를 먹여 P17(이식 전)에서 P30(이식 후)까지 면역 억제되었습니다.

1. 동결 보존 후 Day 32 hESC 유래 광수용체 전구체의 제조

  1. 37°C 수조에서 미리 데워진 광수용체 분화 배지(PRDM).
  2. 액체 질소에서 32일 hESC 유래 광수용체 전구 세포를 포함하는 냉동 수소를 회수합니다. 드라이 아이스에 보관하십시오.
  3. 37°C의 수조에서 3-5분 동안 냉동을 해동합니다. 1mL의 PRDM에 32개의 세포를 재현탁시키고 130 x g 에서 4분 동안 원심분리합니다.
  4. 상층액을 제거하고 PRDM 1mL에 세포를 재현탁시킵니다.
  5. 세포 계수를 위해 혼합물 10μL를 제거합니다. 제조업체의 지침에 따라 0.2% 트리판 블루를 사용하여 셀을 혼합합니다. 피펫 셀 혼합물을 세포 계수 챔버 슬라이드에 넣습니다. 자동화된 세포 계수기로 세포 수와 생존율을 측정합니다.
  6. 세포 생존율이 70% 이상이면 다음 단계로 진행합니다. 나머지 셀 현탁액을 130 x g 에서 4분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 이식을 위해 3 x 105 cells/μL의 농도로 PRDM에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
  7. 눈에 보이는 세포 덩어리를 관찰하십시오. 눈에 보이는 세포 덩어리가 관찰되지 않을 때까지 마이크로퓨지 튜브에 10μL 피펫 팁을 사용하여 세포 덩어리를 반복적으로 재현탁합니다. 33G 주입 주사기에 로드하여 바늘을 통한 세포 용액의 압출을 관찰합니다.

2. rd10 마우스에서 hESC의 망막하 전달

  1. 동물의 준비
    1. 복강 내 접근법으로 27G 바늘에 부착된 1mL 투베르쿨린 주사기에 케타민(체중 20mg/kg)과 자일라진(체중 2mg/kg)의 조합을 사용하여 마우스(P20, 수/암, 3-6g)를 마취합니다. 선제적 진통제로 마우스에 부프레노르핀(0.05mg/kg)을 피하 주사합니다.
    2. 마취제를 투여한 후 동공 확장을 위해 1% 트로피카미드와 2.5% 페닐에프린을 각각 한 방울씩 주입합니다. 안과 젤을 각막에 바르면 안구건조증과 마취 관련 백내장을 예방할 수 있습니다.
    3. 완전히 마취될 때까지 쥐를 빈 케이지에 넣습니다. 발 패드를 꼬집어 적절한 마취 수준을 평가하고 동물이 세게 꼬집어도 반응하지 않는지 확인합니다.
    4. 쥐가 완전히 마취되면 동물을 38°C로 설정된 따뜻한 패드에 놓습니다.
  2. 세포의 망막하 전달
    1. 1포트 유리체 경유 파스 플라나 접근법을 사용하려면 여기에서 수행한 것처럼 무균 환경에서 망막하 주사를 수행합니다. 주입을 수행하기 위해 직사광선 경로가 있는 정립 작동 현미경을 사용하십시오.
    2. 니들 허브를 제거하여 10μL 유리 주사기를 준비합니다. 33G 뭉툭한 바늘을 유리 주사기에 장착합니다. 금속 허브 커버를 잡고 바늘을 주사기에 조심스럽게 고정합니다.
    3. 증류수로 씻어내어 바늘의 누출 및 개통의 징후가 있는지 확인합니다. 주사기를 비우고 조심스럽게 옆에 놓습니다.
    4. 마취된 쥐를 베개 위에 놓고 치료 눈이 현미경의 대물렌즈를 똑바로 올려다봅니다. 0.5% 프로파라카인 염산염을 바르고 30초 동안 기다립니다. 150μL의 안과 젤을 눈에 바르고 그 위에 둥근 커버 슬립을 놓습니다.
    5. 각막, 홍채, 동공, 수정체, 결막을 관찰하여 눈을 대략적으로 검사합니다. 동공을 통해 초점면을 조정하여 쥐 눈의 안저를 시각화합니다. 시신경 헤드가 동공 중앙에 위치할 때까지 헤드를 조정하고 베개에 적절한 위치를 지정하여 헤드의 움직임을 최소화합니다.
    6. hESC가 있는 튜브 바닥을 여러 번 부드럽게 두드려 균일한 세포 현탁액을 얻습니다. 33G의 뭉툭한 바늘이 있는 10μL 유리 마이크로리터 주사기를 사용하여 2μL의 세포/배지를 빼냅니다. 주사기에 세포 침전/뭉침을 방지하기 위해 주사 직전에 세포를 빼냅니다.
    7. 30G 일회용 바늘을 사용하여 변두리 뒤쪽 2mm에 절제술 상처를 만듭니다. 렌즈를 만지지 않도록 바늘의 각도를 ~45°로 유지하십시오. 바늘 끝이 눈에 보이면 바늘을 부드럽게 빼냅니다. 바늘 찔림 부상을 방지하기 위해 사용 후에는 바늘을 날카로운 통에 버리십시오.
    8. 유리 주사기를 가지고 뭉툭한 바늘을 절제술 상처에 삽입합니다. 수정체를 만지지 않고 뭉툭한 바늘이 상처의 반대쪽 망막에 도달할 때까지 전진시킵니다. 출혈을 방지하기 위해 주사 부위에 주요 망막 혈관이 없는지 확인하십시오.
    9. 공막의 압력 가지가 보일 때까지 망막을 부드럽게 관통합니다. 바늘의 뭉툭한 끝을 공막과 평행하게 유지하여 세포가 유리체 공간으로 누출되는 것을 방지합니다.
    10. 주사기에 부드러운 압력이 유지되는 동안 2μL의 세포 현탁액 또는 PRDM 배지(대조군)를 망막하 공간에 천천히 주입합니다. 주사가 성공하면 주사 부위에 눈에 보이는 블레브(즉, 세포 현탁액/배지가 있는 융기된 망막)가 형성되어야 합니다.
      알림: 주사 중에는 망막이 찢어지거나 바늘 끝의 세포가 막히지 않도록 부드러운 압력만 사용해야 합니다.
    11. 블렙을 확인한 후 세포가 가라앉을 때까지 10초 동안 기다립니다. 눈에서 바늘을 부드럽게 빼냅니다.
  3. 블렙의 수술 중 광간섭 단층촬영(OCT) 스캔(옵션)
    1. 마우스 눈을 배치하여 머리를 천천히 움직여 현미경 아래에서 블레브를 시각화합니다. 헤드를 부드럽게 잡아 위치를 고정합니다. 추가적인 동공 확장이 필요하지 않습니다. 커버 슬립과 눈에 있는 젤을 제거하지 마십시오. 블렙을 시각화하기 위해 투명한 광학 매체를 제공합니다.
    2. 작동 현미경에 내장된 iOCT 기능을 사용하여 수술 중 OCT를 수행합니다.
    3. OCT 화면에서 Cube 옵션을 누르고 화살표 버튼을 눌러 블렙에 스캔 영역을 배치합니다. 최상의 OCT 품질을 위해 Centering 및 Focus 를 슬라이딩하여 OCT를 조정합니다. Capture/Scan 을 눌러 블렙 영역의 OCT 스캔을 획득합니다. 이미지를 검토하여 스캔 품질을 확인합니다.
  4. 복구
    1. 커버 슬립을 제거하고 거즈로 눈에서 젤을 닦아냅니다. 감염을 예방하기 위해 주사 후 항생제 연고를 한 번 바르십시오.
    2. 동물이 흉골 누움을 유지하고 홈 케이지로 돌아갈 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 따뜻한 조명 아래에서 마취에서 회복되도록 합니다. 주사 후 최소 3일 동안 염증, 감염 및 고통의 징후가 있는지 동물을 모니터링하십시오.
      알림: 150W의 따뜻한 조명은 동물 케이지에서 최소 30cm 떨어져 있어야 하며 화상을 입지 않도록 주의해야 합니다.
    3. 부프레노르핀(0.05mg/kg)을 1일 동안 매시간 8회 또는 수의사의 권고에 따라 피하 주사합니다. 눈에 염증이나 감염이 관찰되면 적절한 치료를 위해 수의사와 상담하십시오.
  5. 기구 세척 및 멸균
    1. 10μL 유리 마이크로리터 주사기와 33G 뭉툭한 바늘을 100% 에탄올 10배로 플러시합니다. 주사기를 증류수로 플래시하여 에탄올을 씻어냅니다.
    2. 유리 주사기와 바늘을 분해합니다. 보관을 위해 주사기를 건조시킵니다.

결과

10μL 유리 주사기는 제조업체의 지침(그림 1)에 따라 조립되었으며, 셀 현탁액/배지를 전달하는 데 사용된 뭉툭한 바늘은 그림 1B에 나와 있습니다. 망막하 주사에 대한 다양한 접근법이 그림 2에 나와 있습니다. 이 프로토콜에서 pars plana 접근 방식을 설명합니다(그림 2C). 유리 주사기에 장착된 뭉툭한 바늘은 ...

토론

망막하 주사는 RPE 및 망막 질환 23,25,26,27,28,31,40을 치료하기 위한 세포 현탁 이식에 사용되어 왔다. 이 접근법은 세포 이식 및 유전자 치료 접근법뿐만 아니라 망막 질환에 대한 새로운 치료 화합물을 평가하는 설치류 연구...

공개

Hwee Goon Tay는 Alder Therapeutics AB의 공동 설립자입니다. 다른 저자는 상충되는 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 말

동결 보존 후 32 hESC 유래 광수용체 전구체를 준비할 수 있도록 기술적 지원을 제공해 주신 Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee 및 Yingying Chung에게 감사드립니다. 이 연구는 H.G.T.에 대한 National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award(NMRC/OFYIRG/0042/2017) 및 National Research Foundation24th Competitive Research Program Grant(CRP24-2020-0083)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.3% TobramycinNovartisNDC  0078-0813-01Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% DexamethasoneNovartisNDC 0078-0876-01Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochlorideAlconNDC 0998-0016-150.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringeTuremoSS01T2713
1% TropicamideAlconNDC 0998-0355-151% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochlorideAlconNDC 0998-0342-052.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plateCostar3526
30 G Disposable needleBecton Dickinson (BD)305128
33 G, 20 mm length blunt needlesHamilton7803-05
Automated Cell CounterNanoEnTekModel: Eve
B27 without Vitamin ALife Technologies125870012%36
BuprenorphineCevaVetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7SigmaC07425 µM36
CyclosporineNovartis260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cellsDUKE-NUS Medical SchoolHuman embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
GauzeWinner Industries Co. Ltd.1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential MediumGibco11710–035
hESC cell line H1WiCell Research InstituteWA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)Peprotech450-02-5010 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)Prospec-Tany TechnogeneCYT-27210 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)Ceva Santé AnimaleKETALAB03
LN-521BiolaminaLN521-021 µg36
mFreSRSTEMCELL Technologies5854
Microlitre glass syringe (10 mL)Hamilton7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)SelleckchemS221510 µM36
N-2 supplementLife TechnologiesA13707-011%36
Non-essential amino acids (NEAA)Gibco11140–0501x36
NutriStem XF MediaSatorius05-100-1A
Operating microscopeZeissOPMI LUMERA 700With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)DUKE-NUS Medical SchoolSee media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
PyruvateGibco11360–0701 mM36
Rd10 miceJackson LaboratoryB6.CXB1-Pde6brd10/J miceGender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g 
Retinoic acidTocris Bioscience0695/500.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)Fisher Scientific12-545-80
SB431542SigmaS43170.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)Troy LaboratoriesLI0605
β-mercaptoethanolLife Technologies21985–0230.1 mM36

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