rd10 마우스에서 인간 배아 줄기 세포 유래 광수용체 전구체의 망막하 전달

요약

동결 보존 후 hESC 유래 광수용체 전구 세포의 제조 및 rd10 마우스에서 이러한 세포의 망막하 전달에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

초록

인간 만능 줄기세포를 이용한 광수용체 세포의 재생은 진행된 단계의 유전성 및 노화 망막 질환 치료에 유망한 치료법입니다. 우리는 인간 재조합 망막 특이적 라미닌 동형 매트릭스가 인간 배아 줄기 세포(hESC)에서 광수용체 전구세포로의 분화를 지원할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, 이들 세포의 망막하 주사는 rd10 설치류 및 토끼 모델에서도 부분적인 회복을 보여주었다. 망막하 주사는 표적 공간과의 근접성으로 인해 눈의 광수용체 세포와 망막 색소 상피(RPE)층에 제약 화합물을 전달하는 데 사용되는 확립된 방법으로 알려져 있습니다. 또한 망막 질환을 치료하기 위해 아데노 관련 바이러스 벡터를 망막 하 공간으로 전달하는 데 사용되었습니다. 쥐 모델에서 제약 화합물 및 세포의 망막하 전달은 쥐 안구 크기의 제약으로 인해 어렵습니다. 이 프로토콜은 유전성 망막염 색소성 돌연변이, rd10 마우스에서 주입을 위한 hESC 유래 광수용체 전구 세포의 제조와 이들 세포의 망막하 전달 기술에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 이 접근법은 표적 부위, 특히 광수용체 변성으로 이어지는 질병이 발생하는 망막의 외부 핵층에 대한 세포 치료를 가능하게 합니다.

서문

유전성 망막 질환과 노화 관련 황반 변성은 광수용체 세포 손실과 결국 실명으로 이어집니다. 망막 광수용체(retinal photoreceptor)는 광전달(즉, 빛을 신경 신호로 변환)을 담당하는 특수 세포로 구성된 망막의 바깥쪽 분절 층입니다. 간상체와 원추세포 광수용체 세포는 망막 색소층(RPE)에 인접해 있습니다¹. 세포 손실을 보상하기 위한 광수용체 세포 대체 요법은 새롭게 발전하고 있는 치료 접근법입니다. 손상된 광수용체 세포를 복원하기 위해 배아 줄기 세포(ESC)^2,3,4, 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 RPE 세포 및 망막 전구 세포(RPC)^4,5,6,7,8을 사용했습니다. 망막과 RPE 사이의 제한된 공간인 망막하 공간은 손상된 광수용체 세포, RPE 및 Mueller 세포....

프로토콜

생체 내 실험은 SingHealth의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 및 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology) 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 지침과 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 새끼들은 사이클로스포린(260g/L)이 함유된 식수를 먹여 P17(이식 전)에서 P30(이식 후)까지 면역 억제되었습니다.

1. 동결 보존 후 Day 32 hESC 유래 광수용체 전구체의 제조

1. 37°C 수조에서 미리 데워진 광수용체 분화 배지(PRDM).
2. 액체 질소에서 32일 hESC 유래 광수용체 전구 세포를 포함하는 냉동 수소를 회수합니다. 드라이 아이스에 보관하십시오.
3. 37°C의 수조에서 3-5분 동안 냉동을 해동합니다. 1mL의 PRDM에 32개의 세포를 재현탁시키고 130 x g 에서 4분 동안 원심분리합니다.
4. 상층액을 제거하고 PRDM 1mL에 세포를 재현탁시킵니다.
5. 세포 계수를 위해 혼합물 10μL를 제거합니다. 제조업체의 지침에 따라 0.2% 트리판 블루를 사용하여....

토론

망막하 주사는 RPE 및 망막 질환 23,25,26,27,28,31,40을 치료하기 위한 세포 현탁 이식에 사용되어 왔다. 이 접근법은 세포 이식 및 유전자 치료 접근법뿐만 아니라 망막 질환에 대한 새로운 치료 화합물을 평가하는 설치류 연구.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3% Tobramycin	Novartis	NDC  0078-0813-01	Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone	Novartis	NDC 0078-0876-01	Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0016-15	0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringe	Turemo	SS01T2713
1% Tropicamide	Alcon	NDC 0998-0355-15	1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0342-05	2.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plate	Costar	3526
30 G Disposable needle	Becton Dickinson (BD)	305128
33 G, 20 mm length blunt needles	Hamilton	7803-05
Automated Cell Counter	NanoEnTek	Model: Eve
B27 without Vitamin A	Life Technologies	12587001	2%36
Buprenorphine	Ceva		Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7	Sigma	C0742	5 µM36
Cyclosporine	Novartis		260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells	DUKE-NUS Medical School		Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
Gauze	Winner Industries Co. Ltd.	1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential Medium	Gibco	11710–035
hESC cell line H1	WiCell Research Institute	WA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02-50	10 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Prospec-Tany Technogene	CYT-272	10 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)	Ceva Santé Animale	KETALAB03
LN-521	Biolamina	LN521-02	1 µg36
mFreSR	STEMCELL Technologies	5854
Microlitre glass syringe (10 mL)	Hamilton	7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)	Selleckchem	S2215	10 µM36
N-2 supplement	Life Technologies	A13707-01	1%36
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140–050	1x36
NutriStem XF Media	Satorius	05-100-1A
Operating microscope	Zeiss	OPMI LUMERA 700	With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)	DUKE-NUS Medical School		See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
Pyruvate	Gibco	11360–070	1 mM36
Rd10 mice	Jackson Laboratory	B6.CXB1-Pde6brd10/J mice	Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g
Retinoic acid	Tocris Bioscience	0695/50	0.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)	Fisher Scientific	12-545-80
SB431542	Sigma	S4317	0.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)	Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)	Troy Laboratories	LI0605
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985–023	0.1 mM36