rd10マウスにおけるヒト胚性幹細胞由来光受容体前駆細胞の網膜下送達

要約

我々は、凍結保存後のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞の調製と、 rd10 マウスにおけるこれらの細胞の網膜下送達のための詳細なプロトコルについて記述する。

要約

ヒト多能性幹細胞を用いた視細胞の再生は、進行期の遺伝性網膜疾患と老化性網膜疾患の両方を治療するための有望な治療法です。ヒト組換え網膜特異的ラミニンアイソフォームマトリックスは、ヒト胚性幹細胞(hESC)の視細胞前駆細胞への分化をサポートできることを示しました。さらに、これらの細胞の網膜下注射も、 rd10 げっ歯類およびウサギモデルで部分的な回復を示しています。網膜下注射は、標的空間に近いため、眼の視細胞および網膜色素上皮(RPE)層に医薬品化合物を送達するために使用されている確立された方法であることが知られています。また、網膜疾患を治療するために、アデノ随伴ウイルスベクターを網膜下腔に送達するためにも使用されています。マウスモデルにおける医薬品化合物および細胞の網膜下送達は、マウス眼球のサイズに制約があるため、困難である。このプロトコルは遺伝の網膜色素変性症の突然変異体、 rd10 マウスのこれらのセルの注入そして網膜の下配達技術のためのhESC得られた光受容体の祖先のセルの準備のための詳しいプロシージャを記述する。このアプローチにより、標的領域、特に視細胞変性につながる疾患が発生する網膜の外側の核層への細胞治療が可能になります。

概要

遺伝性の網膜疾患や加齢黄斑変性症は、視細胞の喪失や最終的には失明につながります。網膜光受容体は、光伝達(すなわち、光をニューロン信号に変換すること)に関与する特殊な細胞で構成される網膜の外側セグメント層です。桿体および錐体視細胞は、網膜色素層(RPE)¹に隣接しています。細胞の損失を補うための光受容体細胞補充療法は、新しく発展している治療アプローチです。損傷した視細胞を修復するために、胚性幹細胞(ESC)^2,3,4、人工多能性幹細胞(iPS細胞)由来RPE細胞、網膜前駆細胞(RPC)^4,5,6,7,8を使用しました。網膜下腔、網膜とRPEの間の閉鎖空間は、その近傍のために損傷した視細胞、RPE、およびミューラー細胞を置き換えるためにこれらの細胞を沈着させる魅力的な場所です9,10,11。

プロトコル

in vivo実験は、SingHealthの動物管理および使用委員会(IACUC)および眼科および眼科研究における動物の使用に関するAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の声明によって承認されたガイドラインとプロトコルに従って行われました。仔犬は、シクロスポリン(260 g / L)を含む飲料水を与えることにより、P17(移植前)からP30(移植後)までの免疫抑制を行いました。

1. 凍結保存後の32日目のヒトES細胞由来光受容体前駆細胞の調製

1. 37°Cのウォーターバスで予熱した光受容体分化培地(PRDM)。
2. 液体窒素から32日目のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞を含むクライオバイアルを回収します。ドライアイスの上に保管してください。
3. クライオバイアルを37°Cのウォーターバスで3〜5分間解凍します。32日目の細胞を1 mLのPRDMに再懸濁し、130 x g で4分間遠心分離します。
4. 上清を除去し、細胞を 1 mL の PRDM に再懸濁します。
5. 細胞計数のために10 μLの混合物を取り除きます。メーカーの指示に従って、0.2%トリパンブルーを使用して細胞を混合します。細胞混合物を細胞計数チャンバースライドにピペットで移します....

ディスカッション

網膜下注射は、RPEおよび網膜疾患を治療するための細胞懸濁移植に使用されています23,25,26,27,28,31,40。このアプローチは、細胞移植や遺伝子治療のアプローチだけでなく、網膜疾患の新規治療化合物を評価するために?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3% Tobramycin	Novartis	NDC  0078-0813-01	Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone	Novartis	NDC 0078-0876-01	Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0016-15	0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringe	Turemo	SS01T2713
1% Tropicamide	Alcon	NDC 0998-0355-15	1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0342-05	2.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plate	Costar	3526
30 G Disposable needle	Becton Dickinson (BD)	305128
33 G, 20 mm length blunt needles	Hamilton	7803-05
Automated Cell Counter	NanoEnTek	Model: Eve
B27 without Vitamin A	Life Technologies	12587001	2%36
Buprenorphine	Ceva		Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7	Sigma	C0742	5 µM36
Cyclosporine	Novartis		260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells	DUKE-NUS Medical School		Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
Gauze	Winner Industries Co. Ltd.	1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential Medium	Gibco	11710–035
hESC cell line H1	WiCell Research Institute	WA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02-50	10 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Prospec-Tany Technogene	CYT-272	10 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)	Ceva Santé Animale	KETALAB03
LN-521	Biolamina	LN521-02	1 µg36
mFreSR	STEMCELL Technologies	5854
Microlitre glass syringe (10 mL)	Hamilton	7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)	Selleckchem	S2215	10 µM36
N-2 supplement	Life Technologies	A13707-01	1%36
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140–050	1x36
NutriStem XF Media	Satorius	05-100-1A
Operating microscope	Zeiss	OPMI LUMERA 700	With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)	DUKE-NUS Medical School		See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
Pyruvate	Gibco	11360–070	1 mM36
Rd10 mice	Jackson Laboratory	B6.CXB1-Pde6brd10/J mice	Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g
Retinoic acid	Tocris Bioscience	0695/50	0.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)	Fisher Scientific	12-545-80
SB431542	Sigma	S4317	0.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)	Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)	Troy Laboratories	LI0605
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985–023	0.1 mM36