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要約

我々は、凍結保存後のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞の調製と、 rd10 マウスにおけるこれらの細胞の網膜下送達のための詳細なプロトコルについて記述する。

要約

ヒト多能性幹細胞を用いた視細胞の再生は、進行期の遺伝性網膜疾患と老化性網膜疾患の両方を治療するための有望な治療法です。ヒト組換え網膜特異的ラミニンアイソフォームマトリックスは、ヒト胚性幹細胞(hESC)の視細胞前駆細胞への分化をサポートできることを示しました。さらに、これらの細胞の網膜下注射も、 rd10 げっ歯類およびウサギモデルで部分的な回復を示しています。網膜下注射は、標的空間に近いため、眼の視細胞および網膜色素上皮(RPE)層に医薬品化合物を送達するために使用されている確立された方法であることが知られています。また、網膜疾患を治療するために、アデノ随伴ウイルスベクターを網膜下腔に送達するためにも使用されています。マウスモデルにおける医薬品化合物および細胞の網膜下送達は、マウス眼球のサイズに制約があるため、困難である。このプロトコルは遺伝の網膜色素変性症の突然変異体、 rd10 マウスのこれらのセルの注入そして網膜の下配達技術のためのhESC得られた光受容体の祖先のセルの準備のための詳しいプロシージャを記述する。このアプローチにより、標的領域、特に視細胞変性につながる疾患が発生する網膜の外側の核層への細胞治療が可能になります。

概要

遺伝性の網膜疾患や加齢黄斑変性症は、視細胞の喪失や最終的には失明につながります。網膜光受容体は、光伝達(すなわち、光をニューロン信号に変換すること)に関与する特殊な細胞で構成される網膜の外側セグメント層です。桿体および錐体視細胞は、網膜色素層(RPE)1に隣接しています。細胞の損失を補うための光受容体細胞補充療法は、新しく発展している治療アプローチです。損傷した視細胞を修復するために、胚性幹細胞(ESC)2,3,4、人工多能性幹細胞(iPS細胞)由来RPE細胞、網膜前駆細胞(RPC)4,5,6,7,8を使用しました。網膜下腔、網膜とRPEの間の閉鎖空間は、その近傍のために損傷した視細胞、RPE、およびミューラー細胞を置き換えるためにこれらの細胞を沈着させる魅力的な場所です9,10,11。

遺伝子治療や細胞治療は、前臨床試験において様々な網膜疾患に対する再生医療に網膜下腔を活用しています。これには、抗センスオリゴヌクレオチド療法12,13またはCRISPR/Cas9、またはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベースの戦略14,15,16、材料の移植(RPEシート、網膜補綴物17,18,19)、分化幹細胞由来網膜オルガノイド20のいずれかの形での遺伝子または遺伝子編集ツールの機能コピーの送達が含まれます、21,22網膜およびRPE関連疾患を治療する。RPE65関連レーバー先天性黒内障(LCA)23,24、CNGA3連鎖色覚異常25、MERTK関連網膜色素変性症26、脈絡膜血症27,28,29,30を治療するための網膜下腔におけるhESC-RPE31を用いた臨床試験効果的なアプローチであることが証明されています。損傷部位付近に細胞を直接注入することで、適切な領域への細胞の沈降、シナプス統合、および最終的な視覚的改善の可能性が大幅に向上します。

ヒトおよび大型眼モデル(すなわち、ブタ32,33,34,35、ウサギ36,37,38,39,40、および非ヒト霊長類41,42,43)への網膜下注射が確立されていますが、マウスモデルへのそのような注射は、眼球のサイズと巨大さの制約のために依然として困難ですマウスの目44、45、46を占めるレンズ。しかし、遺伝子改変モデルは小動物でのみ容易に利用でき、大型動物(ウサギやヒト以外の霊長類)では入手できないため、マウスへの網膜下注射は、網膜遺伝性疾患の新しい治療法を検討するために注目を集めています。細胞またはAAVを網膜下腔に送達するために、3つの主要なアプローチ、すなわち経角膜経路、経強膜経路、および扁平部経路が使用されています(図2を参照)。経角膜および経強膜経路は、白内障形成、癒着、脈絡膜出血、および注射部位からの逆流に関連しています11,44,45,47,48,49。射出プロセスを直接可視化するパースプラナアプローチを採用し、顕微鏡下でリアルタイムに射出部位を把握することができます。

我々は最近、組換えヒト網膜特異的ラミニンアイソフォームLN523を用いて、ゼノフリーの化学的に定義された条件下でヒト胚性幹細胞(hESC)を光受容体前駆細胞に分化させる方法を記載した。LN523が網膜に存在することがわかったので、ヒト網膜の細胞外マトリックスニッチが in vitro で再現され、それによってヒトES細胞からの光受容体の分化をサポートできるという仮説を立てました36。シングルセルトランスクリプトーム解析により、コーンロッドホメオボックスとリフェリンを共発現する光受容体前駆細胞が32日後に生成されることが示されました。常染色体ヒト網膜色素変性症を模倣した網膜変性10(rd10)変異マウスモデルを用いて、ヒトES細胞由来光受容体前駆細胞32日目の生体内における有効性を評価し た。ヒトES細胞由来の視細胞前駆細胞を、視受容器の機能不全と変性が進行しているP20の rd10 マウスの網膜下腔に注入した36。ここでは、凍結保存後のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞の調製と rd10 マウスの網膜下腔への送達に関する詳細なプロトコルについて説明します。この方法は、AAV、細胞懸濁液、ペプチド、または化学物質をマウスの網膜下腔に投与するためにも使用できます。

プロトコル

in vivo実験は、SingHealthの動物管理および使用委員会(IACUC)および眼科および眼科研究における動物の使用に関するAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の声明によって承認されたガイドラインとプロトコルに従って行われました。仔犬は、シクロスポリン(260 g / L)を含む飲料水を与えることにより、P17(移植前)からP30(移植後)までの免疫抑制を行いました。

1. 凍結保存後の32日目のヒトES細胞由来光受容体前駆細胞の調製

  1. 37°Cのウォーターバスで予熱した光受容体分化培地(PRDM)。
  2. 液体窒素から32日目のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞を含むクライオバイアルを回収します。ドライアイスの上に保管してください。
  3. クライオバイアルを37°Cのウォーターバスで3〜5分間解凍します。32日目の細胞を1 mLのPRDMに再懸濁し、130 x g で4分間遠心分離します。
  4. 上清を除去し、細胞を 1 mL の PRDM に再懸濁します。
  5. 細胞計数のために10 μLの混合物を取り除きます。メーカーの指示に従って、0.2%トリパンブルーを使用して細胞を混合します。細胞混合物を細胞計数チャンバースライドにピペットで移します。自動セルカウンターで細胞数と生存率を決定します。
  6. 細胞生存率が70%を超えたら次のステップに進みます。残りの細胞懸濁液を130 x g で4分間遠心分離します。上清を除去し、細胞ペレットを3 x 105 細胞/μLの濃度でPRDMに再懸濁して移植します。
  7. 目に見える細胞の塊を観察します。10 μLのピペットチップをマイクロチューブに入れて、目に見える細胞凝集が観察されなくなるまで、細胞凝集を繰り返し再懸濁します。33G注射シリンジに装填し、針を通して細胞溶液が押し出されるのを観察します。

2. rd10 マウスにおけるヒトES細胞の網膜下送達

  1. 動物の準備
    1. 腹腔内アプローチにより、27Gの針に取り付けられた1 mLのツベルクリン注射器でケタミン(20 mg / kg体重)とキシラジン(2 mg / kg体重)の組み合わせを使用して、マウス(P20、男性/女性、3〜6 g)を麻酔します。先制鎮痛薬としてマウスにブプレノルフィン(0.05 mg / kg)の皮下注射を投与します。.
    2. 麻酔後、瞳孔散大のために1%トロピカミドと2.5%フェニレフリンをそれぞれ点滴します。角膜に眼科用ジェルを塗布して、目の乾燥や麻酔関連の白内障を防ぎます。
    3. 完全に麻酔されるまでマウスを空のケージに入れます。肉球をつまんで適切な麻酔レベルを評価し、動物が強くつまんでも反応しないかどうかを確認します。
    4. マウスが完全に麻酔されたら、38°Cに設定された温かいパッドの上にマウスを置きます。
  2. 細胞の網膜下送達
    1. ここで行うように、1ポート経硝子体扁平部アプローチを使用するには、無菌環境で網膜下注射を実行します。直接光路を備えた直立手術用顕微鏡を使用して注入を行います。
    2. ニードルハブを取り外して、10 μLのガラスシリンジを準備します。33G鈍針をガラスシリンジに取り付けます。金属製のハブカバーを取り、針をシリンジに慎重に固定します。
    3. 蒸留水で洗い流して、針の漏れや開存性の兆候がないか確認します。シリンジを空にして、慎重に横に置きます。
    4. 麻酔をかけたマウスを枕の上に置き、治療眼を顕微鏡の対物レンズにまっすぐ見上げます。0.5%のプロパラカインの塩酸塩を加え、30秒待ちます。眼科用ジェル150μLを眼に塗布し、その上に丸いカバースリップを置きます。
    5. 角膜、虹彩、瞳孔、水晶体、結膜を観察して、目の大まかな検査を行います。瞳孔を通して、焦点面を調整してマウスの眼底を視覚化します。視神経ヘッドが瞳孔の中心に配置されるまでヘッドを調整し、枕に適切に配置して頭の動きを最小限に抑えます。
    6. チューブの底部をhESCで複数回軽くたたいて、均一な細胞懸濁液を得ます。10 μLのガラスマイクロリットルシリンジと33Gの鈍い針を使用して、2 μLの細胞/培地を回収します。注射の直前に細胞を抜いて、シリンジ内での細胞の沈降/凝集を防ぎます。
    7. 30Gの使い捨て針を使用して、リンバスの後ろに2mmのところに硬化切除の傷を作ります。レンズに触れないように、針の角度を~45°に保ちます。針の先端が目に映ったら、針をそっと引き抜きます。針刺しによる怪我を防ぐために、使用後は針を鋭利なビンに捨ててください。
    8. ガラス注射器を取り、鈍い針を硬化切除術の傷口に挿入します。レンズに触れずに、鈍い針を進入創の反対側の網膜に達するまで進めます。出血を避けるために、注射領域に主要な網膜血管がないことを確認してください。.
    9. 強膜の圧力分岐が見られるまで、網膜を静かに貫通します。針の鈍い端を強膜と平行に保ち、細胞が硝子体腔に漏れないようにします。
    10. 2 μLの細胞懸濁液またはPRDM培地(コントロール)を、シリンジに穏やかな圧力を維持しながら、網膜下腔にゆっくりと注入します。注射が成功すると、目に見えるブレブ(すなわち、細胞懸濁液/培地が入った網膜の隆起)が注射部位に形成されるはずです。
      注:注射中は、網膜の裂傷や針先の細胞の閉塞を避けるために、穏やかな圧力のみを使用する必要があります。
    11. ブレブを確認したら、細胞が落ち着くまで10秒待ちます。針を目からそっと引っ込めます。
  3. ブレブの術中光干渉断層撮影(OCT)スキャン(オプション)
    1. マウスの目の位置を調整し、頭をゆっくりと動かして顕微鏡下でブレブを視覚化します。頭をそっと持って位置を固定します。追加の瞳孔散大は必要ありません。カバースリップや目のジェルを剥がさないでください。それはblebを視覚化するための明確な光学媒体を与える。
    2. 手術用顕微鏡に内蔵されているiOCT機能を使用して、術中OCTを行います。
    3. OCT画面の Cube(キューブ )オプションを押し、 矢印 ボタンを押してスキャン領域をブレブに配置します。 センタリングとフォーカス をスライドさせてOCTを調整し、最高のOCT品質を実現します。 Capture/Scan(キャプチャ/スキャン )を押して、ブレブ領域のOCTスキャンを取得します。画像を確認して、スキャンの品質を確認します。
  4. 回復
    1. カバースリップをはがし、ガーゼで目からジェルをきれいにします。感染を防ぐために、注射後に抗生物質軟膏を1回塗布します。
    2. 動物が胸骨臥位を維持してホームケージに戻るのに十分な意識を取り戻すまで、温かい光の下で麻酔から回復するのを待ちます。注射後少なくとも3日間、炎症、感染、苦痛の兆候がないか動物を監視します。.
      注意: 150Wのウォームライトは、動物ケージから少なくとも30cm離す必要があり、火傷をしないように注意する必要があります。
    3. ブプレノルフィン(0.05 mg / kg)の皮下注射を8時間ごとに1日間、または獣医師の推奨に従って投与します。.目の炎症や感染が観察された場合は、獣医師に相談して適切な治療を受けてください。
  5. 器具の洗浄と滅菌
    1. 10 μLのガラスマイクロリットルシリンジと33Gの鈍い針を100%エタノールで10回洗い流します。シリンジを蒸留水で点滅させてエタノールを洗い流します。
    2. ガラスシリンジと針を分解します。シリンジを乾燥させて保管します。

結果

10 μL のガラスシリンジはメーカーの指示に従って組み立て(図 1)、細胞懸濁液/培地の送達に使用した鈍い針を 図 1B に示します。網膜下注射のさまざまなアプローチを 図2に示します。このプロトコルでは、pars planaアプローチについて説明します(図2C)。ガラス注射器に取り付けられた鈍い針は、硬化切?...

ディスカッション

網膜下注射は、RPEおよび網膜疾患を治療するための細胞懸濁移植に使用されています23,25,26,27,28,31,40。このアプローチは、細胞移植や遺伝子治療のアプローチだけでなく、網膜疾患の新規治療化合物を評価するために?...

開示事項

Hwee Goon Tayは、Alder Therapeutics ABの共同設立者です。他の著者は、競合する利害関係がないと宣言しています。

謝辞

凍結保存後32日目のヒトES細胞由来光受容体前駆細胞の調製に技術支援を提供してくれたWei Sheng Tan氏、Luanne Chiang Xue Yen氏、Xinyi Lee氏、Yingying Chung氏に感謝します。この研究の一部は、National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award(NMRC/OFYIRG/0042/2017)およびNational Research Foundation24th Competitive Research Program Grant(CRP24-2020-0083)からH.G.T.への助成金によって支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.3% TobramycinNovartisNDC  0078-0813-01Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% DexamethasoneNovartisNDC 0078-0876-01Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochlorideAlconNDC 0998-0016-150.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringeTuremoSS01T2713
1% TropicamideAlconNDC 0998-0355-151% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochlorideAlconNDC 0998-0342-052.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plateCostar3526
30 G Disposable needleBecton Dickinson (BD)305128
33 G, 20 mm length blunt needlesHamilton7803-05
Automated Cell CounterNanoEnTekModel: Eve
B27 without Vitamin ALife Technologies125870012%36
BuprenorphineCevaVetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7SigmaC07425 µM36
CyclosporineNovartis260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cellsDUKE-NUS Medical SchoolHuman embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
GauzeWinner Industries Co. Ltd.1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential MediumGibco11710–035
hESC cell line H1WiCell Research InstituteWA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)Peprotech450-02-5010 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)Prospec-Tany TechnogeneCYT-27210 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)Ceva Santé AnimaleKETALAB03
LN-521BiolaminaLN521-021 µg36
mFreSRSTEMCELL Technologies5854
Microlitre glass syringe (10 mL)Hamilton7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)SelleckchemS221510 µM36
N-2 supplementLife TechnologiesA13707-011%36
Non-essential amino acids (NEAA)Gibco11140–0501x36
NutriStem XF MediaSatorius05-100-1A
Operating microscopeZeissOPMI LUMERA 700With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)DUKE-NUS Medical SchoolSee media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
PyruvateGibco11360–0701 mM36
Rd10 miceJackson LaboratoryB6.CXB1-Pde6brd10/J miceGender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g 
Retinoic acidTocris Bioscience0695/500.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)Fisher Scientific12-545-80
SB431542SigmaS43170.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)Troy LaboratoriesLI0605
β-mercaptoethanolLife Technologies21985–0230.1 mM36

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