A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية المتعددة لأنسجة سرطان الرئة المضمنة في البارافين
In This Article
Summary
يصف هذا البروتوكول التجريبي ويحسن طريقة تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية المتعددة (IHC) ، وذلك أساسا عن طريق تحسين ظروف حضانة الأجسام المضادة أحادية القناة وضبط إعدادات الأجسام المضادة والقنوات لحل مشاكل التألق الذاتي وتداخل القناة في أنسجة سرطان الرئة ذات الأصل السريري.
Abstract
سرطان الرئة هو السبب الرئيسي للمراضة والوفيات المرتبطة بالأورام الخبيثة في جميع أنحاء العالم ، وقد اعتبرت البيئة المكروية المعقدة للورم السبب الرئيسي للوفاة في مرضى سرطان الرئة. يتطلب تعقيد البيئة المكروية للورم طرقا فعالة لفهم العلاقات بين الخلايا في أنسجة الورم. أصبحت تقنية الكيمياء الهيستولوجية المناعية المتعددة (mIHC) أداة رئيسية لاستنتاج العلاقة بين التعبير عن البروتينات في المنبع والمصب لمسارات الإشارات في أنسجة الورم وتطوير التشخيصات السريرية وخطط العلاج. mIHC هي طريقة تلطيخ مناعي متعدد الملصقات تعتمد على تقنية تضخيم إشارة التيرامين (TSA) ، والتي يمكنها اكتشاف جزيئات مستهدفة متعددة في نفس عينة قسم الأنسجة في وقت واحد لتحقيق تعبير مشترك مختلف للبروتين وتحليل التوطين المشترك. في هذا البروتوكول التجريبي ، تعرضت أقسام الأنسجة المضمنة بالبارافين لسرطان الرئة الحرشفية من أصل سريري لتلطيخ كيميائي مناعي متعدد الإرسال. من خلال تحسين البروتوكول التجريبي ، تم تحقيق تلطيخ كيميائي مناعي متعدد للخلايا والبروتينات المستهدفة المصنفة ، مما أدى إلى حل مشكلة التألق الذاتي والحديث المتبادل للقناة في أنسجة الرئة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام التلوين الكيميائي المناعي المتعدد على نطاق واسع في التحقق التجريبي من التسلسل عالي الإنتاجية المرتبط بالورم ، بما في ذلك تسلسل الخلية الواحدة ، والبروتينات ، وتسلسل مساحة الأنسجة ، مما يوفر نتائج تحقق بديهية وبصرية لعلم الأمراض.
Introduction
تضخيم إشارة التيرامين (TSA) ، الذي له تاريخ يزيد عن 20 عاما ، هو فئة من تقنيات الفحص التي تستخدم بيروكسيديز الفجل (HRP) لوضع العلامات عالية الكثافة في الموقع للمستضدات المستهدفة ويتم تطبيقها على نطاق واسع في مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) ، والتهجين في الموقع (ISH) ، والكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) ، وغيرها من التقنيات للكشف عن المستضدات البيولوجية ، تحسين حساسية الإشارة المكتشفة بشكل كبير1. تم مؤخرا تطوير تلطيخ أوبال متعدد الألوان على أساس تقنية TSA واستخدامه على نطاق واسع في العديد من الدراسات2،3،4،
Protocol
تمت الموافقة على البروتوكول من خلال المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات في مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان ، الصين. تم الحصول على عينات أنسجة سرطان الرئة أثناء الجراحة في مركز سرطان الرئة في مستشفى غرب الصين ، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من كل مريض.
1. إعداد قسم الأنسجة
- إعداد FFPE
- اغمر الأنسجة السريرية في محلول فورمالين محايد لأكثر من 72 ساعة.
- أكمل عملية تجفيف الأنسجة باستخدام الزيلين والمحاليل الكحولية المتدرجة20.
- قم بإجراء التضمين اليدوي للبارافين وتقسيم الأنسجة بسمك مقطع 4 ميكرومتر. استخدم شرائح مجهر الالتصاق للتأكد من عدم سقوط شرائح الأنسجة.
- تخب....
النتائج
قمنا بتحسين مخطط المطابقة للأجسام المضادة الأولية CD8 والفلوروفور. تتوافق كلتا المجموعتين من نتائج التألق مع نفس ظروف حضانة الأجسام المضادة بالضبط في المجموعة التجريبية ، باستثناء التغيير في الفلوروفور المطابق للأجسام المضادة. كما هو موضح في الشكل 2 ، كان هناك اختلاف كبير .......
Discussion
mIHC هي تقنية تجريبية لا غنى عنها في مجال البحث العلمي للتحليل الكمي والمكاني لعلامات البروتين المتعددة على مستوى الخلية الواحدة في قسم نسيج واحد ، مما يوفر بيانات بديهية ودقيقة لدراسة أمراض المرض من خلال التركيز على بنية الأنسجة التفصيلية والتفاعلات الخلوية في سياق الأنسجة الأصلية. سيتطل.......
Disclosures
يعلن جميع المؤلفين أنه لا يوجد تضارب في المصالح.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا أعضاء معهد أبحاث علم الأمراض السريرية في مستشفى غرب الصين ، الذين ساهموا في التوجيه الفني لجودة التألق المناعي المتعدد ومعالجة IHC. تم دعم هذا البروتوكول من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82200078).
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Anti-CD8 | Abcam | ab237709 | Primary antibody, 1/100, PH9 |
| Anti-CD68 | Abcam | ab955 | Primary antibody, 1/300, PH9 |
| Anti-CK5/6 | Millipore | MAB1620 | Primary antibody, 1/150, PH9 |
| Anti-HMGCS1 | GeneTex | GTX112346 | Primary antibody, 1/300, PH6 |
| Animal nonimmune serum | MXB Biotechnologies | SP KIT-B3 | Antigen blocking |
| Fluormount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Anti-fluorescent burst |
| Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit | Akoya | NEL861001KT | Opal mIHC Staining |
| Wash Buffer | Dako | K8000/K8002/K8007/K8023 | Washing the tissues slides |
| Software | |||
| HALO | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
| inForm | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
| PerkinElmer Vectra | multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides. | ||
| QuPath 0.3.2 | intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment. |
References
- Zaidi, A. U., Enomoto, H., Milbrandt, J., Roth, K. A. Dual fluorescent in situ hybridization and immunohistochemical detection with tyramide signal amplification. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (10), 1369-1375 (2000).
- Lovisa, S., et al.
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved