Coloração por imunohistoquímica multiplex para tecido de câncer de pulmão embebido em parafina

Resumo

Este protocolo experimental descreve e otimiza um método de coloração por imunoistoquímica multiplex (IHQ), principalmente otimizando as condições de incubação de anticorpos de canal único e ajustando as configurações de anticorpos e canais para resolver os problemas de autofluorescência e crosstalk de canais em tecidos de câncer de pulmão de origem clínica.

Resumo

O câncer de pulmão é a principal causa de morbidade e mortalidade relacionada a tumores malignos em todo o mundo, e o complexo microambiente tumoral tem sido considerado a principal causa de morte em pacientes com câncer de pulmão. A complexidade do microambiente tumoral requer métodos eficazes para compreender as relações célula-célula em tecidos tumorais. A técnica de imunohistoquímica multiplex (mIHC) tornou-se uma ferramenta chave para inferir a relação entre a expressão de proteínas a montante e a jusante de vias de sinalização em tecidos tumorais e desenvolver diagnósticos clínicos e planos de tratamento. O mIHC é um método de coloração por imunofluorescência multimarcados baseado na tecnologia Tyramine Signal Amplification (TSA), que pode detectar simultaneamente várias moléculas-alvo na mesma amostra de seção de tecido para obter diferentes análises de co-expressão e co-localização de proteínas. Neste protocolo experimental, cortes teciduais embebidos em parafina de carcinoma escamoso de pulmão de origem clínica foram submetidos à coloração imunoistoquímica multiplex. Através da otimização do protocolo experimental, a coloração imunoistoquímica multiplex de células-alvo e proteínas marcadas foi obtida, resolvendo o problema de autofluorescência e crosstalk de canais em tecidos pulmonares. Além disso, a coloração imunoistoquímica multiplex é amplamente utilizada na validação experimental de sequenciamento de alto rendimento relacionado a tumores, incluindo sequenciamento de célula única, proteômica e sequenciamento de espaço tecidual, fornecendo resultados intuitivos e visuais de validação patológica.

Introdução

A amplificação do sinal da tiramina (TSA), que tem uma história de mais de 20 anos, é uma classe de técnicas de ensaio que usam peroxidase de raiz forte (HRP) para marcação in situ de alta densidade de antígenos-alvo e é amplamente aplicada em ensaios imunoenzimáticos (ELISAs), hibridização in situ (ISH), imunohistoquímica (IHQ) e outras técnicas para a detecção de antígenos biológicos, melhorando substancialmente a sensibilidade do sinal detectado¹. A coloração policromática Opala baseada na tecnologia TSA tem sido recentemente desenvolvida e amplamente utilizada em diversos estudos2,3,4,5.....

Protocolo

O protocolo é aprovado pelas diretrizes do Comitê de Ética do West China Hospital, Universidade de Sichuan, China. As amostras de tecido de câncer de pulmão foram obtidas durante a cirurgia no Centro de Câncer de Pulmão do West China Hospital, e consentimento informado foi obtido de cada paciente.

1. Preparo dos cortes teciduais

1. Preparação FFPE
   1. Imergir os tecidos clínicos em solução de formalina neutra por mais de 72 horas.
   2. Completar o processo de desidratação dos tecidos com xileno e soluções alcoólicas graduadas²⁰.
   3. Realizar a inclusão manual de parafina e o co....

Discussão

A mIHC é uma técnica experimental indispensável no campo da pesquisa científica para a análise quantitativa e espacial de múltiplos marcadores proteicos em nível de célula única em uma única seção de tecido, fornecendo dados intuitivos e precisos para o estudo da patologia da doença, concentrando-se na estrutura detalhada do tecido e nas interações celulares no contexto do tecido original. A adoção generalizada da tecnologia mIHC exigirá protocolos experimentais otimizados e eficazes. Para abordar os pr.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Anti-CD8	Abcam	ab237709	Primary antibody, 1/100, PH9
Anti-CD68	Abcam	ab955	Primary antibody, 1/300, PH9
Anti-CK5/6	Millipore	MAB1620	Primary antibody, 1/150, PH9
Anti-HMGCS1	GeneTex	GTX112346	Primary antibody, 1/300, PH6
Animal nonimmune serum	MXB Biotechnologies	SP KIT-B3	Antigen blocking
Fluormount-G	SouthernBiotech	0100-01	Anti-fluorescent burst
Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit	Akoya	NEL861001KT	Opal mIHC Staining
Wash Buffer	Dako	K8000/K8002/K8007/K8023	Washing the tissues slides
Software
HALO			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
inForm			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
PerkinElmer Vectra			multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.
QuPath 0.3.2			intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.