Coloração por imunohistoquímica multiplex para tecido de câncer de pulmão embebido em parafina

Resumo

Este protocolo experimental descreve e otimiza um método de coloração por imunoistoquímica multiplex (IHQ), principalmente otimizando as condições de incubação de anticorpos de canal único e ajustando as configurações de anticorpos e canais para resolver os problemas de autofluorescência e crosstalk de canais em tecidos de câncer de pulmão de origem clínica.

Resumo

O câncer de pulmão é a principal causa de morbidade e mortalidade relacionada a tumores malignos em todo o mundo, e o complexo microambiente tumoral tem sido considerado a principal causa de morte em pacientes com câncer de pulmão. A complexidade do microambiente tumoral requer métodos eficazes para compreender as relações célula-célula em tecidos tumorais. A técnica de imunohistoquímica multiplex (mIHC) tornou-se uma ferramenta chave para inferir a relação entre a expressão de proteínas a montante e a jusante de vias de sinalização em tecidos tumorais e desenvolver diagnósticos clínicos e planos de tratamento. O mIHC é um método de coloração por imunofluorescência multimarcados baseado na tecnologia Tyramine Signal Amplification (TSA), que pode detectar simultaneamente várias moléculas-alvo na mesma amostra de seção de tecido para obter diferentes análises de co-expressão e co-localização de proteínas. Neste protocolo experimental, cortes teciduais embebidos em parafina de carcinoma escamoso de pulmão de origem clínica foram submetidos à coloração imunoistoquímica multiplex. Através da otimização do protocolo experimental, a coloração imunoistoquímica multiplex de células-alvo e proteínas marcadas foi obtida, resolvendo o problema de autofluorescência e crosstalk de canais em tecidos pulmonares. Além disso, a coloração imunoistoquímica multiplex é amplamente utilizada na validação experimental de sequenciamento de alto rendimento relacionado a tumores, incluindo sequenciamento de célula única, proteômica e sequenciamento de espaço tecidual, fornecendo resultados intuitivos e visuais de validação patológica.

Introdução

A amplificação do sinal da tiramina (TSA), que tem uma história de mais de 20 anos, é uma classe de técnicas de ensaio que usam peroxidase de raiz forte (HRP) para marcação in situ de alta densidade de antígenos-alvo e é amplamente aplicada em ensaios imunoenzimáticos (ELISAs), hibridização in situ (ISH), imunohistoquímica (IHQ) e outras técnicas para a detecção de antígenos biológicos, melhorando substancialmente a sensibilidade do sinal detectado¹. A coloração policromática Opala baseada na tecnologia TSA tem sido recentemente desenvolvida e amplamente utilizada em diversos estudos2,3,4,5. A coloração tradicional por imunofluorescência (IF) fornece aos pesquisadores uma ferramenta fácil para a detecção e comparação da distribuição de proteínas nas células e tecidos de vários organismos modelo. Baseia-se na ligação anticorpo/antígeno-específico e inclui abordagens direta e indireta⁶. A imunomarcação direta envolve o uso de um anticorpo primário conjugado a fluoróforos contra o antígeno de interesse, que permite a detecção fluorescente direta usando um microscópio de fluorescência. A imunomarcação indireta envolve a aplicação de um anticorpo secundário conjugado a fluoróforos contra o anticorpo primário não conjugado ^6,7.

Os métodos tradicionais de coloração por imunofluorescência de marcação única podem manchar apenas um, dois ou, em alguns casos, três antígenos nos tecidos, o que é uma grande limitação na mineração da rica informação contida nos cortes teciduais. A interpretação dos resultados quantitativos muitas vezes depende da observação visual e da quantificação precisa por softwares de imagem, como o ImageJ. Existem limitações técnicas, como restrição de espécies de anticorpos, sinais fracos de marcação fluorescente e sobreposição de cor do corante fluorescente (Tabela 1). A técnica Opal multiplex IHC (mIHC) é baseada na derivação TSA, que permite a coloração multiplex e marcação diferencial de mais de 7-9 antígenos no mesmo corte tecidual, sem restrição quanto à origem do anticorpo primário, mas requer alta especificidade do anticorpo correspondente contra o antígeno. O procedimento de coloração é semelhante ao da coloração de imunofluorescência normal, exceto por duas diferenças: cada rodada de coloração envolve o uso de apenas um anticorpo e uma etapa de eluição de anticorpos é adicionada. Anticorpos ligados ao antígeno por ligações não covalentes podem ser removidos por eluição por micro-ondas, mas o sinal fluorescente TSA ligado à superfície do antígeno por ligações covalentes é mantido.

Moléculas de tiramina (T) ativadas marcadas com o corante são altamente enriquecidas no antígeno alvo, permitindo a amplificação eficiente do sinal fluorescente. Isso permite a marcação direta do antígeno sem interferência de anticorpos, e então a marcação multicolor pode ser obtida após múltiplos ciclos de coloração8,9,10 (Figura 1). Embora essa tecnologia produza imagens confiáveis e precisas para o estudo da doença, a criação de uma estratégia útil de coloração por imunoistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) pode ser demorada e exigente devido à necessidade de extensa otimização e projeto. Portanto, este protocolo de painel multiplex foi otimizado em um corante IHQ automatizado com um tempo de coloração menor do que o protocolo manual. Essa abordagem pode ser diretamente aplicada e adaptada por qualquer pesquisador para estudos imuno-oncológicos em amostras de tecido humano fixadas em formalina e emblocadas em parafina (FFPE)¹¹. Além disso, os métodos de preparação de lâminas, otimização de anticorpos e planejamento multiplex serão úteis na obtenção de imagens robustas que representem interações celulares precisas in situ e para encurtar o período de otimização para análise manual¹².

O mfIHC inclui principalmente aquisição de imagens e análise de dados. Em termos de aquisição de imagens, amostras coradas com complexos marcados multicoloridos precisam ser detectadas com equipamentos profissionais de imagem espectral para identificar os vários sinais de cores mistas e obter imagens de alto sinal para ruído sem interferência da autofluorescência tecidual. Os equipamentos atuais para imagens espectrais incluem principalmente microscópios confocais espectrais e sistemas de imagem de tecidos multiespectrais. O sistema multiespectral de imagem tecidual é um sistema de imagem profissional projetado para a análise quantitativa de cortes teciduais, e sua característica mais importante é a aquisição de informações espectrais de imagem, que fornecem tanto informações de estrutura morfológica quanto de mapeamento óptico de amostras de tecido biológico^13,14. Qualquer pixel na imagem espectral contém uma curva espectral completa, e cada corante (incluindo autofluorescência) tem seu espectro característico correspondente, o que permite o registro completo e a identificação precisa de sinais multirótulos mistos e sobrepostos.

Em termos de análise de dados, as amostras marcadas com multicores são extremamente complexas devido à estrutura morfológica e às células constituintes das amostras de tecido. O software comum não pode identificar automaticamente diferentes tipos de tecido. Assim, softwares inteligentes de análise quantitativa de tecidos são utilizados para análise quantitativa da expressão de antígenos em regiões específicas 15,16,17,18.

Acima de tudo, a coloração por imunofluorescência multimarcada fusionada com tecnologia de imagem multiespectral e análise anatomopatológica quantitativa tem as vantagens de um grande número de alvos de detecção, coloração eficaz e análise precisa, podendo, portanto, melhorar significativamente a precisão da análise histomorfológica, revelar a relação espacial entre proteínas com resolução em nível celular e ajudar a extrair informações mais ricas e confiáveis de amostras de cortes de tecido¹⁹ (Tabela 1).

Protocolo

O protocolo é aprovado pelas diretrizes do Comitê de Ética do West China Hospital, Universidade de Sichuan, China. As amostras de tecido de câncer de pulmão foram obtidas durante a cirurgia no Centro de Câncer de Pulmão do West China Hospital, e consentimento informado foi obtido de cada paciente.

1. Preparo dos cortes teciduais

1. Preparação FFPE
   1. Imergir os tecidos clínicos em solução de formalina neutra por mais de 72 horas.
   2. Completar o processo de desidratação dos tecidos com xileno e soluções alcoólicas graduadas²⁰.
   3. Realizar a inclusão manual de parafina e o corte do tecido com uma espessura de secção de 4 μm. Use lâminas de microscópio de adesão para garantir que as fatias de tecido não caiam.
   4. Asse as lâminas em forno a 65 °C por 2 h para garantir que o tecido e as lâminas estejam secos. Conservar numa caixa de correr à temperatura ambiente.
2. Pré-tratamento de secção tecidual
   1. Pré-tratar as lâminas de tecido em estufa a 65 °C por 5 min e, em seguida, imergir sequencialmente em soluções de xileno por 2 x 15 min, soluções de etanol anidro por 2 x 15 min, solução de etanol a 90% por 10 min, solução de etanol a 85% por 10 min, solução de etanol a 80% por 10 min e solução de etanol a 75% por 10 min, Em seguida, lavando as lâminas com água esterilizada por 3 x 1 min.
      NOTA: Esta técnica experimental só pode ser usada para tecido FFPE, não para tecido congelado ou fresco, pois o processo de reparo de antígeno de alta temperatura múltipla faz com que o tecido caia da lâmina.

2. Otimização do anticorpo primário

NOTA: Experimentos convencionais de IHQ foram usados para determinar as condições de incubação de anticorpos individuais, incluindo principalmente a concentração de anticorpos e condições de reparo de antígenos. Consulte as condições no manual de instruções de anticorpos.

1. Use uma concentração de anticorpos ligeiramente superior à faixa de concentração recomendada e valores intermediários.
2. Otimizar as rotinas de tampão de recuperação de antígenos PH6 e PH9 de acordo com o local de expressão proteica. Use PH9 para proteínas expressas no núcleo e use rotina (PH6 ou PH9) para outras proteínas.

3. Método de coloração mIHC

NOTA: A coloração mIHC Opal é um dos métodos mIHC disponíveis. Neste protocolo experimental de 5 cores, como cada amostra de tecido precisa ser corada com quatro anticorpos, quatro incubações primárias de anticorpos, incubações secundárias de anticorpos e incubações cromogênicas de amplificação do sinal de TSA, bem como cinco restaurações antigênicas são necessárias. Finalmente, a coloração com 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e o selamento do agente de ruptura antifluorescente são realizados.

1. Preparação do reagente principal
   NOTA: Determine a quantidade de reagente a ser adicionada de acordo com o tamanho das lâminas de tecido. Use volume suficiente para cobrir completamente a seção de tecido (geralmente, 50-150 μL por lâmina). As soluções de trabalho necessárias para a experiência são preparadas da seguinte forma:
   1. Solução de trabalho do tampão de lavagem: diluir 20x Amortecedor de lavagem a 1:20 com água bidestilada e armazenar à temperatura ambiente.
   2. Solução de trabalho do tampão PH6: Diluir o tampão PH6 de 100x a 1:100 com água bidestilada. Preparar antes da utilização e conservar à temperatura ambiente.
   3. Solução de trabalho do tampão PH9: Diluir o tampão PH9 de 50x a 1:50 com água bidestilada. Preparar antes da utilização e conservar à temperatura ambiente.
   4. Polímero HRP: Prepare esta solução pronta para uso apenas para anticorpos primários de origem de coelho e camundongo.
   5. Solução de trabalho de fluoróforo: Reconstituir cada pó de fluoróforo (exceto fluoróforo 780) em 75 μL de DMSO. Antes de cada procedimento, diluir o fluoróforo em diluente de amplificação 1x a 1:100. Eliminar qualquer porção não utilizada da solução de trabalho do fluoróforo.
   6. Solução de trabalho de fluoróforo 780: Reconstituir TSA-DIG em 75 μL de DMSO e o pó de fluoróforo 780 em 300 μL de água bidestilada. Antes do procedimento, diluir TSA-DIG em diluente de amplificação 1x a 1:100 e diluir fluoróforo 780 com diluente Ab a 1:25.
   7. Solução de trabalho DAPI: Diluir a solução DAPI a 1:50 com água bidestilada ou PBS. Preparar antes da utilização e conservar a 4 °C durante um período não superior a 48 h.
      NOTA. Lave as lâminas apenas com água bidestilada e solução de trabalho de tampão de lavagem recém-preparada durante este experimento de coloração de fluorescência multilabel. Os cortes de tecido não devem entrar em contacto com a água da torneira; Contaminantes na água da torneira podem aderir aos cortes de tecido e causar autofluorescência. Mantenha as amostras longe da luz durante todo o experimento.
2. Recuperação de antígenos
   1. Coloque as lâminas em uma caixa de coloração e reparo e preencha-a com solução de trabalho de buffer PH6 ou PH9, cubra com a tampa e aqueça em um forno de micro-ondas por 2 x 8 min a 100% de potência.
      NOTA: Adicione água bidestilada à caixa de reparo durante o processo de aquecimento para evitar a evaporação excessiva que pode fazer com que as fatias sequem.
   2. Deixe as lâminas arrefecerem à temperatura ambiente antes de prosseguir (30-60 min).
   3. Lave as lâminas 3 x 2 min com água bidestilada. Use uma caneta de barreira hidrofóbica para circundar a seção de tecido na lâmina.
3. Bloqueio
   1. Imergir os cortes de tecido em tampão de lavagem, cobrir com solução de bloqueio e incubar as lâminas em uma câmara umidificada à temperatura ambiente por 10 min.
4. Incubação primária de anticorpos
   1. Remova a solução de bloqueio das lâminas e cubra as secções de tecido com a solução de trabalho de anticorpos primários. Incubar as lâminas numa câmara humidificada durante 1 h a 37 °C na incubadora ou durante a noite a 4 °C no frigorífico.
      OBS: Não deixe as lâminas secarem.
5. Introdução do Polímero HRP
   1. Lave as lâminas em solução de trabalho tampão de lavagem por 3 x 2 min. Adicione o polímero HRP diretamente aos cortes de tecido e incube por 15 min à temperatura ambiente.
      NOTA: Para lâminas armazenadas na geladeira, mantenha-as em temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos antes da lavagem para remover o anticorpo primário.
6. Geração de amplificação do sinal de tiramina (TSA)
   1. Lave a lâmina com a solução de trabalho do tampão de lavagem por 3 x 2 min, adicione a solução de trabalho de fluoróforo diretamente aos cortes de tecido e incube por 10 min à temperatura ambiente. Lave a lâmina com a solução de trabalho do tampão de lavagem por 3 x 2 min.
7. Procedimento especial para fluoróforo 780
   NOTA: O fluoróforo 780 é fraco e é rotineiramente colocado em último lugar no esquema de correspondência de cores de todo o experimento. O fluoróforo 780 normalmente não é utilizado neste protocolo experimental, mas devido à sua especificidade, suas etapas experimentais são listadas.
   1. Introdução do TSA-DIG
      1. Lave a lâmina com solução de trabalho tampão de lavagem por 3 x 2 min, adicione a solução de trabalho TSA-Drg gota a gota às seções de tecido e incube por 10 min à temperatura ambiente.
   2. Tratamento por micro-ondas
      1. Lave as lâminas com a solução de trabalho do tampão de lavagem por 3 x 2 min.
      2. Coloque as lâminas em uma caixa de coloração e reparo, preencha-a com solução de reparo, cubra com a tampa e aqueça em um forno de micro-ondas por 2 x 8 min a 100% de potência. Deixe as lâminas arrefecerem à temperatura ambiente antes de prosseguir (30-60 min).
      3. Lave as lâminas por 3 x 2 min com água bidestilada.
   3. Geração de sinal de fluoróforo 780
      1. Imergir as seções em tampão de lavagem, cobrir com solução de trabalho fluoróforo 780 e incubar as lâminas em uma câmara umidificada por 1 h à temperatura ambiente.
      2. Lave as lâminas com a solução de trabalho do tampão de lavagem por 3 x 2 min.
         OBS: NÃO realize tratamento por micro-ondas após esta etapa.
   4. Use o fluoróforo 780 como a última etapa de todo o fluxo de trabalho e, em seguida, core os núcleos diretamente com a solução de trabalho DAPI.
      Observação : pule a etapa 3.7 se não estiver usando fluoróforo 780.
8. Tratamento por micro-ondas
   NOTA: Esta etapa de micro-ondas retira o complexo HRP primário-secundário e reexpõe antígenos, permitindo a introdução do próximo anticorpo primário.
   1. Coloque as lâminas em uma caixa de coloração e reparo, preencha-a com a solução de trabalho tampão PH6 ou PH9, cubra com a tampa e aqueça em um forno de micro-ondas por 2 x 8 min a 100% de potência.
   2. Deixe as lâminas arrefecerem à temperatura ambiente antes de prosseguir (30-60 min). Lave as lâminas 3 x 1 min com água bidestilada.
   3. Mergulhe as lâminas na solução de trabalho do tampão de lavagem por 2 min. Realizar a próxima incubação de anticorpos.
9. Próxima incubação de anticorpos
   1. Repita as etapas 3.2-3.8 (exceto a etapa 3.7).
10. Coloração nuclear celular e selamento tecidual
    1. Cobrir os cortes de tecido com a solução de trabalho DAPI e incubar as lâminas em uma câmara umidificada por 5 min à temperatura ambiente. Lave as lâminas por 3 x 2 min com água bidestilada.
    2. Retire as gotículas de água das lâminas, adicione 10-20 μL de quencher antifluorescência a cada lâmina e sele as lâminas com um vidro de cobertura do microscópio.
    3. Conservar as lâminas acabadas a 4 °C, protegidas da luz, durante mais de 1 mês.
       NOTA: Tome cuidado para evitar bolhas de ar.

4. Configurar o controle negativo

1. Processe as lâminas de controle negativo como as lâminas contendo tecido, mas sem a adição de reagentes como anticorpos primários, anticorpos secundários, reagentes de TSA e DAPI, que são usados para remover a autofluorescência do tecido ao escanear o filme.

5. Varredura totalmente automática de lâminas de tecido

NOTA: O equipamento usado para imagens espectrais é um analisador de quantificação de tecido multiespectral totalmente automatizado, e a visualização de imagens e análises de lâminas de 5 cores pode ser realizada usando o sistema referenciado (consulte Tabela de Materiais). O sistema usa imagens multiespectrais para desmistura quantitativa de múltiplos fluoróforos e autofluorescência tecidual.

1. Defina manualmente o tempo de exposição e o programa de varredura para cada canal de fluorescência e confirme se o instrumento completou a exposição e a varredura totalmente automáticas das lâminas de tecido.
   NOTA: A superfície da lâmina deve estar limpa e isenta de filme de água. Cuidado com a quantidade de seladora: o excesso fará com que a tampa escorregue e o instrumento reporte um erro.

6. Análise de fluorescência

1. Clique duas vezes no software (consulte a Tabela de Materiais), arraste o arquivo de imagem de fluorescência multicolorida obtido da varredura original para o software e defina o tipo de imagem como fluorescência.
2. Clique no botão Brilho e contraste e verifique os canais no painel. Clique fora e, em seguida, no canal para selecionar o canal de fluorescência de interesse. Arraste a tela Min e a tela Max para ajustar o brilho e o contraste de cada canal.
3. Após a análise, determine a exibição a ser salva, clique em Mostrar visão geral do slide e Mostrar localização do cursor para remover esses dois conteúdos, mantenha a barra de escala e clique em Arquivo | Instantâneo de exportação | Conteúdo do visualizador atual para exportar um arquivo PNG.
   NOTA: Cada canal de fluorescência e uma figura mesclada devem ser exportados para análise futura.
4. Para uma análise mais aprofundada da positividade da célula-alvo, utilize o software de identificação e segmentação celular²¹ (ver Tabela de Materiais).

Resultados

Otimizamos o esquema de pareamento de anticorpos CD8 primários e fluoróforos. Ambos os conjuntos de resultados de fluorescência corresponderam exatamente às mesmas condições de incubação de anticorpos no grupo experimental, exceto pela mudança no fluoróforo pareado por anticorpos. Como mostrado na Figura 2, houve diferença significativa na correspondência de canais de células T CD8+ com fluoróforo 480 e fluoróforo 690. O canal com fluoróforo 690 apresenta fundo fluorescente e...

Discussão

A mIHC é uma técnica experimental indispensável no campo da pesquisa científica para a análise quantitativa e espacial de múltiplos marcadores proteicos em nível de célula única em uma única seção de tecido, fornecendo dados intuitivos e precisos para o estudo da patologia da doença, concentrando-se na estrutura detalhada do tecido e nas interações celulares no contexto do tecido original. A adoção generalizada da tecnologia mIHC exigirá protocolos experimentais otimizados e eficazes. Para abordar os pr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Anti-CD8	Abcam	ab237709	Primary antibody, 1/100, PH9
Anti-CD68	Abcam	ab955	Primary antibody, 1/300, PH9
Anti-CK5/6	Millipore	MAB1620	Primary antibody, 1/150, PH9
Anti-HMGCS1	GeneTex	GTX112346	Primary antibody, 1/300, PH6
Animal nonimmune serum	MXB Biotechnologies	SP KIT-B3	Antigen blocking
Fluormount-G	SouthernBiotech	0100-01	Anti-fluorescent burst
Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit	Akoya	NEL861001KT	Opal mIHC Staining
Wash Buffer	Dako	K8000/K8002/K8007/K8023	Washing the tissues slides
Software
HALO			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
inForm			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
PerkinElmer Vectra			multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.
QuPath 0.3.2			intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.