Colorazione immunoistochimica multiplex per tessuto di carcinoma polmonare incluso in paraffina

Riepilogo

Questo protocollo sperimentale descrive e ottimizza un metodo di colorazione immunoistochimica multiplex (IHC), principalmente ottimizzando le condizioni di incubazione degli anticorpi a canale singolo e regolando le impostazioni degli anticorpi e dei canali per risolvere i problemi di autofluorescenza e diafonia dei canali nei tessuti di cancro del polmone di origine clinica.

Abstract

Il cancro del polmone è la principale causa di morbilità e mortalità correlata al tumore maligno in tutto il mondo e il complesso microambiente tumorale è stato considerato la principale causa di morte nei pazienti affetti da cancro al polmone. La complessità del microambiente tumorale richiede metodi efficaci per comprendere le relazioni cellula-cellula nei tessuti tumorali. La tecnica dell'immunoistochimica multipla (mIHC) è diventata uno strumento chiave per dedurre la relazione tra l'espressione delle proteine a monte e a valle delle vie di segnalazione nei tessuti tumorali e per sviluppare diagnosi cliniche e piani di trattamento. mIHC è un metodo di colorazione a immunofluorescenza multi-etichetta basato sulla tecnologia Tyramine Signal Amplification (TSA), in grado di rilevare simultaneamente più molecole bersaglio sullo stesso campione di sezione di tessuto per ottenere diverse analisi di co-espressione e co-localizzazione delle proteine. In questo protocollo sperimentale, sezioni di tessuto di carcinoma squamoso polmonare di origine clinica incluse in paraffina sono state sottoposte a colorazione immunoistochimica multiplex. Ottimizzando il protocollo sperimentale, è stata ottenuta la colorazione immunoistochimica multiplex di cellule e proteine bersaglio marcate, risolvendo il problema dell'autofluorescenza e della diafonia dei canali nei tessuti polmonari. Inoltre, la colorazione immunoistochimica multiplex è ampiamente utilizzata nella convalida sperimentale del sequenziamento ad alto rendimento correlato al tumore, tra cui il sequenziamento di singole cellule, la proteomica e il sequenziamento dello spazio tissutale, fornendo risultati intuitivi e visivi di convalida della patologia.

Introduzione

L'amplificazione del segnale della tiramina (TSA), che ha una storia di oltre 20 anni, è una classe di tecniche di analisi che utilizzano la perossidasi di rafano (HRP) per la marcatura in situ ad alta densità di antigeni bersaglio ed è ampiamente applicata nei saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), nell'ibridazione in situ (ISH), nell'immunoistochimica (IHC) e in altre tecniche per la rilevazione di antigeni biologici. migliorare in modo sostanziale la sensibilità del segnale rilevato¹. La colorazione policromatica opalina basata sulla tecnologia TSA è stata recentemente sviluppata e ampiamente utilizzata in diversi....

Protocollo

Il protocollo è approvato dalle linee guida del Comitato Etico del West China Hospital, Sichuan University, Cina. I campioni di tessuto del cancro al polmone sono stati ottenuti durante l'intervento chirurgico nel Centro per il cancro al polmone presso l'ospedale della Cina occidentale ed è stato ottenuto il consenso informato da ciascun paziente.

1. Preparazione della sezione tissutale

1. Preparazione FFPE
   1. Immergere i tessuti clinici in una soluzione di formalina neutra per più di 72 ore.
   2. Completare il processo di disidratazione dei tessuti utilizzando xilene e soluzioni alcoliche classificate

Discussione

La mIHC è una tecnica sperimentale indispensabile nel campo della ricerca scientifica per l'analisi quantitativa e spaziale di più marcatori proteici a livello di singola cellula in una singola sezione tissutale, fornendo dati intuitivi e accurati per lo studio della patologia patologica concentrandosi sulla struttura tissutale dettagliata e sulle interazioni cellulari nel contesto del tessuto originale. L'adozione diffusa della tecnologia mIHC richiederà protocolli sperimentali ottimizzati ed efficaci. Per affrontare.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Anti-CD8	Abcam	ab237709	Primary antibody, 1/100, PH9
Anti-CD68	Abcam	ab955	Primary antibody, 1/300, PH9
Anti-CK5/6	Millipore	MAB1620	Primary antibody, 1/150, PH9
Anti-HMGCS1	GeneTex	GTX112346	Primary antibody, 1/300, PH6
Animal nonimmune serum	MXB Biotechnologies	SP KIT-B3	Antigen blocking
Fluormount-G	SouthernBiotech	0100-01	Anti-fluorescent burst
Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit	Akoya	NEL861001KT	Opal mIHC Staining
Wash Buffer	Dako	K8000/K8002/K8007/K8023	Washing the tissues slides
Software
HALO			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
inForm			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
PerkinElmer Vectra			multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.
QuPath 0.3.2			intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.