Tinción inmunohistoquímica multiplex para tejido de cáncer de pulmón incluido en parafina

Resumen

Este protocolo experimental describe y optimiza un método de tinción de inmunohistoquímica múltiple (IHQ), principalmente mediante la optimización de las condiciones de incubación de anticuerpos de un solo canal y el ajuste de la configuración de anticuerpos y canales para resolver los problemas de autofluorescencia y diafonía de canales en tejidos de cáncer de pulmón de origen clínico.

Resumen

El cáncer de pulmón es la principal causa de morbilidad y mortalidad relacionadas con tumores malignos en todo el mundo, y el complejo microambiente tumoral se ha considerado la principal causa de muerte en pacientes con cáncer de pulmón. La complejidad del microambiente tumoral requiere métodos eficaces para comprender las relaciones de célula a célula en los tejidos tumorales. La técnica de inmunohistoquímica múltiple (mIHC) se ha convertido en una herramienta clave para inferir la relación entre la expresión de proteínas aguas arriba y aguas abajo de las vías de señalización en los tejidos tumorales y desarrollar diagnósticos clínicos y planes de tratamiento. mIHC es un método de tinción de inmunofluorescencia multietiqueta basado en la tecnología de amplificación de señal de tiramina (TSA), que puede detectar simultáneamente múltiples moléculas diana en la misma muestra de sección de tejido para lograr diferentes análisis de coexpresión y colocalización de proteínas. En este protocolo experimental, secciones de tejido incluido en parafina de carcinoma escamoso de pulmón de origen clínico se sometieron a tinción inmunohistoquímica múltiple. Mediante la optimización del protocolo experimental, se logró la tinción inmunohistoquímica multiplex de células diana y proteínas marcadas, resolviendo el problema de la autofluorescencia y la diafonía de canales en los tejidos pulmonares. Además, la tinción inmunohistoquímica multiplex se utiliza ampliamente en la validación experimental de la secuenciación de alto rendimiento relacionada con tumores, incluida la secuenciación de una sola célula, la proteómica y la secuenciación del espacio tisular, lo que proporciona resultados intuitivos y visuales de validación de patologías.

Introducción

La amplificación de la señal de tiramina (TSA), que tiene una historia de más de 20 años, es una clase de técnicas de ensayo que utilizan peroxidasa de rábano picante (HRP) para el marcaje in situ de alta densidad de antígenos diana y se aplica ampliamente en ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA), hibridación in situ (ISH), inmunohistoquímica (IHC) y otras técnicas para la detección de antígenos biológicos. mejorar sustancialmente la sensibilidad de la señal detectada¹. La tinción policromática de ópalo basada en la tecnología TSA ha sido desarrollada recientemente y ampliamente utilizada en varios estudios

Protocolo

El protocolo está aprobado por las directrices del Comité de Ética del Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan, China. Las muestras de tejido de cáncer de pulmón se obtuvieron durante la cirugía en el Centro de Cáncer de Pulmón del Hospital de China Occidental, y se obtuvo el consentimiento informado de cada paciente.

1. Preparación de la sección de tejido

1. Preparación FFPE
   1. Sumergir los tejidos clínicos en una solución de formalina neutra durante más de 72 h.
   2. Completar el proceso de deshidratación de los tejidos utilizando xileno y soluciones alcohólicas graduadas^20<....

Discusión

La mIHC es una técnica experimental indispensable en el campo de la investigación científica para el análisis cuantitativo y espacial de múltiples marcadores proteicos a nivel de una sola célula en una sola sección de tejido, proporcionando datos intuitivos y precisos para el estudio de la patología de la enfermedad centrándose en la estructura tisular detallada y las interacciones celulares en el contexto del tejido original. La adopción generalizada de la tecnología mIHC requerirá protocolos experimentales .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Anti-CD8	Abcam	ab237709	Primary antibody, 1/100, PH9
Anti-CD68	Abcam	ab955	Primary antibody, 1/300, PH9
Anti-CK5/6	Millipore	MAB1620	Primary antibody, 1/150, PH9
Anti-HMGCS1	GeneTex	GTX112346	Primary antibody, 1/300, PH6
Animal nonimmune serum	MXB Biotechnologies	SP KIT-B3	Antigen blocking
Fluormount-G	SouthernBiotech	0100-01	Anti-fluorescent burst
Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit	Akoya	NEL861001KT	Opal mIHC Staining
Wash Buffer	Dako	K8000/K8002/K8007/K8023	Washing the tissues slides
Software
HALO			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
inForm			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
PerkinElmer Vectra			multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.
QuPath 0.3.2			intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.