石蜡包埋肺癌组织的多重免疫组化染色

摘要

该实验方案描述并优化了一种多重免疫组化（IHC）染色方法，主要通过优化单通道抗体孵育条件和调整抗体和通道的设置来解决临床来源的肺癌组织中的自发荧光和通道串扰问题。

摘要

肺癌是全世界恶性肿瘤相关发病率和死亡率的主要原因，复杂的肿瘤微环境被认为是肺癌患者死亡的主要原因。肿瘤微环境的复杂性需要有效的方法来了解肿瘤组织中的细胞间关系。多重免疫组化（mIHC）技术已成为推断肿瘤组织信号通路上游和下游蛋白质表达之间关系以及制定临床诊断和治疗计划的关键工具。mIHC是一种基于酪胺信号放大（TSA）技术的多标记免疫荧光染色方法，可同时检测同一组织切片样品上的多个靶分子，实现不同的蛋白质共表达和共定位分析。在该实验方案中，对临床来源的肺鳞状癌的石蜡包埋组织切片进行多重免疫组织化学染色。通过优化实验方案，实现了标记靶细胞和蛋白的多重免疫组织化学染色，解决了肺组织中的自发荧光和通道串扰问题。此外，多重免疫组化染色广泛应用于肿瘤相关、高通量测序的实验验证，包括单细胞测序、蛋白质组学和组织空间测序，提供直观、可视化的病理学验证结果。

引言

酪胺信号扩增（TSA）已有20多年的历史，是一类利用辣根过氧化物酶（HRP）对靶抗原进行高密度原位标记的检测技术，广泛应用于酶联免疫吸附测定（ELISA）、原位杂交（ISH）、免疫组化（IHC）等生物抗原检测技术。 大幅提高检测信号的灵敏度¹.基于 TSA 技术的蛋白石多色染色最近被开发出来并广泛用于多项研究 2,3,4,5。传统的免疫荧光 （IF） 染色为研究人员提供了一种简单的工具，用于检测和比较各种模式生物细胞和组织中蛋白质的分布。它基于抗体/抗原特异性结合，包括直接和间接方法⁶。直接免疫染色涉及使用荧光团偶联的一抗来对抗目标抗原，从而可以使用荧光显微镜进行直接荧光检测。间接免疫染色方法涉及应用荧光团偶联的二抗来对抗非偶联的一抗^6,7。

传统的单标记免疫荧光染色方法只能对组织中的一种、两种或在某些情况下三种抗原进行染色，这是挖掘组织切片中包含的丰富信息的主要限制。定量结果....

研究方案

该协议已获得中国四川大学华西医院伦理委员会的指导意见。在华西医院肺癌中心手术时采集肺癌组织样本，并征得每位患者的知情同意书。

1.组织切片准备

1. FFPE制备
   1. 将临床组织浸入中性福尔马林溶液中超过72小时。
   2. 使用二甲苯和分级酒精溶液²⁰完成组织脱水的过程。
   3. 以 4 μm 切片厚度进行手动石蜡包埋和组织切片。使用粘附显微镜载玻片确保组织切片不会脱落。
   4. 将载玻片在65°C的烤箱中烘烤2小时，以确保组织和载玻片干燥。在室温下储存在载玻片盒中。
2. 组织切片预处理
   1. 将组织载玻片在65°C的烘箱中预处理5分钟，然后依次浸入二甲苯溶液中2×15分钟，无水乙醇溶液2×15分钟，90%乙醇溶液10分钟，85%乙醇溶液10分钟，80%乙醇溶液10分钟，75%乙醇溶液10分钟， 然后用消毒水清洗载玻片 3 x 1 分钟。
      注意：该实验技术仅适用于FFPE组织，不适用于冷冻或新鲜组织，因为多次高温抗原修复过程会导致组织从载玻片上脱落。

2. 一抗优化

注：常规IHC实验用于确定单个抗体的....

讨论

mIHC是科学研究领域中不可缺少的实验技术，用于在单个组织切片中对单细胞水平的多种蛋白质标记物进行定量和空间分析，通过关注原始组织背景下的详细组织结构和细胞相互作用，为疾病病理学研究提供直观准确的数据。mIHC技术的广泛采用将需要优化和有效的实验方案。为了解决实验中可能出现的问题，我们提出了以下考虑和解决方案。

首先，根据多色实验中抗原与荧光.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Anti-CD8	Abcam	ab237709	Primary antibody, 1/100, PH9
Anti-CD68	Abcam	ab955	Primary antibody, 1/300, PH9
Anti-CK5/6	Millipore	MAB1620	Primary antibody, 1/150, PH9
Anti-HMGCS1	GeneTex	GTX112346	Primary antibody, 1/300, PH6
Animal nonimmune serum	MXB Biotechnologies	SP KIT-B3	Antigen blocking
Fluormount-G	SouthernBiotech	0100-01	Anti-fluorescent burst
Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit	Akoya	NEL861001KT	Opal mIHC Staining
Wash Buffer	Dako	K8000/K8002/K8007/K8023	Washing the tissues slides
Software
HALO			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
inForm			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
PerkinElmer Vectra			multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.
QuPath 0.3.2			intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.