Parafine Gömülü Akciğer Kanseri Dokusu için Multipleks İmmünohistokimya Boyama

Özet

Bu deneysel protokol, esas olarak tek kanallı antikor inkübasyon koşullarını optimize ederek ve klinik kökenli akciğer kanseri dokularında otofloresan ve kanal karışma problemlerini çözmek için antikorların ve kanalların ayarlarını ayarlayarak bir multipleks immünohistokimya (IHC) boyama yöntemini tanımlar ve optimize eder.

Özet

Akciğer kanseri, tüm dünyada malign tümöre bağlı morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir ve kompleks tümör mikroçevresi, akciğer kanseri hastalarında önde gelen ölüm nedeni olarak kabul edilmektedir. Tümör mikroçevresinin karmaşıklığı, tümör dokularındaki hücreden hücreye ilişkileri anlamak için etkili yöntemler gerektirir. Multipleks immünohistokimya (mIHC) tekniği, tümör dokularındaki sinyal yolaklarının yukarı ve aşağı akışındaki proteinlerin ekspresyonu arasındaki ilişkiyi anlamak ve klinik tanı ve tedavi planları geliştirmek için önemli bir araç haline gelmiştir. mIHC, farklı protein ortak ekspresyonu ve birlikte lokalizasyon analizi elde etmek için aynı doku kesiti numunesi üzerinde birden fazla hedef molekülü aynı anda tespit edebilen Tiramin Sinyal Amplifikasyonu (TSA) teknolojisine dayanan çok etiketli bir immünofloresan boyama yöntemidir. Bu deneysel protokolde, klinik kökenli akciğer skuamöz karsinomunun parafine gömülü doku kesitleri multipleks immünohistokimyasal boyamaya tabi tutuldu. Deneysel protokolü optimize ederek, etiketli hedef hücrelerin ve proteinlerin multipleks immünohistokimyasal boyanması sağlandı ve akciğer dokularında otofloresan ve kanal karışması sorunu çözüldü. Ek olarak, multipleks immünohistokimyasal boyama, tek hücreli dizileme, proteomik ve doku boşluğu dizilemesi dahil olmak üzere tümörle ilgili, yüksek verimli dizilemenin deneysel olarak doğrulanmasında yaygın olarak kullanılır ve sezgisel ve görsel patoloji doğrulama sonuçları sağlar.

Giriş

20 yılı aşkın bir geçmişe sahip olan tiramin sinyal amplifikasyonu (TSA), hedef antijenlerin yüksek yoğunluklu in situ etiketlemesi için yaban turpu peroksidaz (HRP) kullanan bir test teknikleri sınıfıdır ve enzime bağlı immünosorbent testlerinde (ELISA'lar), in situ hibridizasyon (ISH), immünohistokimya (IHC) ve biyolojik antijenlerin saptanması için diğer tekniklerde yaygın olarak uygulanır. algılanan sinyalin hassasiyetini önemli ölçüde artırmak¹. TSA teknolojisine dayalı opal polikromatik boyama yakın zamanda geliştirilmiş ve çeşitli çalışmalarda yaygın olarak kullanılmıştır^2,3,4,5

Protokol

Protokol, Çin'deki Sichuan Üniversitesi, Batı Çin Hastanesi Etik Komitesi'nin yönergeleri tarafından onaylanmıştır. Akciğer kanseri doku örnekleri, Batı Çin Hastanesi Akciğer Kanseri Merkezi'ndeki ameliyat sırasında alındı ve her hastadan bilgilendirilmiş onam alındı.

1. Doku kesiti hazırlığı

1. FFPE hazırlama
   1. Klinik dokuları 72 saatten fazla nötr formalin çözeltisine daldırın.
   2. Ksilen ve dereceli alkollü çözeltiler kullanarak dokuları kurutmak işlemini tamamlayın²⁰.
   3. 4 μm kesit kalınlığında manuel parafin gömme ve doku kesiti gerçekleştirin. Doku dilimlerinin düşmem....

Tartışmalar

mIHC, tek bir doku kesitinde tek hücre düzeyinde çoklu protein belirteçlerinin kantitatif ve mekansal analizi için bilimsel araştırma alanında vazgeçilmez bir deneysel tekniktir ve orijinal doku bağlamında ayrıntılı doku yapısına ve hücresel etkileşimlere odaklanarak hastalık patolojisinin incelenmesi için sezgisel ve doğru veriler sağlar. mIHC teknolojisinin yaygın olarak benimsenmesi, optimize edilmiş ve etkili deneysel protokoller gerektirecektir. Deneylerde ortaya çıkabilecek sorunları ele .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Anti-CD8	Abcam	ab237709	Primary antibody, 1/100, PH9
Anti-CD68	Abcam	ab955	Primary antibody, 1/300, PH9
Anti-CK5/6	Millipore	MAB1620	Primary antibody, 1/150, PH9
Anti-HMGCS1	GeneTex	GTX112346	Primary antibody, 1/300, PH6
Animal nonimmune serum	MXB Biotechnologies	SP KIT-B3	Antigen blocking
Fluormount-G	SouthernBiotech	0100-01	Anti-fluorescent burst
Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit	Akoya	NEL861001KT	Opal mIHC Staining
Wash Buffer	Dako	K8000/K8002/K8007/K8023	Washing the tissues slides
Software
HALO			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
inForm			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
PerkinElmer Vectra			multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.
QuPath 0.3.2			intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.