Мультиплексное иммуногистохимическое окрашивание тканей рака легкого, залитых парафином

Резюме

Данный экспериментальный протокол описывает и оптимизирует метод мультиплексного иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания, в основном за счет оптимизации условий инкубации одноканальных антител и корректировки настроек антител и каналов для решения проблем аутофлуоресценции и перекрестных помех каналов в тканях рака легкого клинического происхождения.

Аннотация

Рак легких является ведущей причиной заболеваемости и смертности от злокачественных опухолей во всем мире, а сложное опухолевое микроокружение считается основной причиной смерти пациентов с раком легких. Сложность опухолевого микроокружения требует эффективных методов для понимания межклеточных взаимоотношений в опухолевых тканях. Метод мультиплексной иммуногистохимии (mIHC) стал ключевым инструментом для выяснения взаимосвязи между экспрессией белков выше и ниже сигнальных путей в опухолевых тканях и разработки клинических диагнозов и планов лечения. mIHC — это метод иммунофлуоресцентного окрашивания с несколькими метками, основанный на технологии усиления сигнала тирамина (TSA), который может одновременно обнаруживать несколько молекул-мишеней на одном и том же образце среза ткани для достижения различной коэкспрессии белка и анализа колокализации. В данном экспериментальном протоколе залитые парафином срезы тканей плоскоклеточной карциномы легкого клинического генеза подвергали мультиплексному иммуногистохимическому окрашиванию. Оптимизировав протокол эксперимента, удалось добиться мультиплексного иммуногистохимического окрашивания меченых клеток-мишеней и белков, решив проблему аутофлуоресценции и перекрестных помех каналов в легочных тканях. Кроме того, мультиплексное иммуногистохимическое окрашивание широко используется для экспериментальной валидации высокопроизводительного секвенирования, связанного с опухолью, включая секвенирование отдельных клеток, протеомику и секвенирование тканевого пространства, обеспечивая интуитивно понятные и визуальные результаты валидации патологии.

Введение

Тираминовая амплификация сигнала (TSA), которая имеет более чем 20-летнюю историю, представляет собой класс методов анализа, в которых используется пероксидаза хрена (HRP) для мечения целевых антигенов in situ высокой плотности и широко применяется в иммуноферментных анализах (ИФА), гибридизации in situ (ISH), иммуногистохимии (IHC) и других методах обнаружения биологических антигенов. существенное повышение чувствительности детектируемого сигнала¹. Опаловое полихроматическое окрашивание по технологии TSA было разработано недавно и широко используется в нескольких исследованиях 2,3,4,5.

протокол

Протокол утвержден руководящими принципами Комитета по этике Западно-Китайского госпиталя Сычуаньского университета, Китай. Образцы ткани рака легких были получены во время операции в Центре рака легких Западно-Китайского госпиталя, и от каждого пациента было получено информированное согласие.

1. Подготовка тканевого среза

1. Подготовка к FFPE
   1. Погрузить клинические ткани в нейтральный раствор формалина более чем на 72 ч.
   2. Завершают процесс обезвоживания тканей с помощью ксилола и градуированных спиртовых растворов²⁰.
   3. Выполняйте ручное заделывание парафина и секциони....

Результаты

Оптимизирована схема подбора первичных антител CD8 и флуорофоров. Оба набора результатов флуоресценции соответствовали точно таким же условиям инкубации антител в экспериментальной группе, за исключением изменения флуорофора, соответствующего антителам. Как показано на р?.......

Обсуждение

mIHC является незаменимым экспериментальным методом в области научных исследований для количественного и пространственного анализа множественных белковых маркеров на уровне одной клетки в одном срезе ткани, предоставляя интуитивно понятные и точные данные для изучения патологии заб?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Anti-CD8	Abcam	ab237709	Primary antibody, 1/100, PH9
Anti-CD68	Abcam	ab955	Primary antibody, 1/300, PH9
Anti-CK5/6	Millipore	MAB1620	Primary antibody, 1/150, PH9
Anti-HMGCS1	GeneTex	GTX112346	Primary antibody, 1/300, PH6
Animal nonimmune serum	MXB Biotechnologies	SP KIT-B3	Antigen blocking
Fluormount-G	SouthernBiotech	0100-01	Anti-fluorescent burst
Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit	Akoya	NEL861001KT	Opal mIHC Staining
Wash Buffer	Dako	K8000/K8002/K8007/K8023	Washing the tissues slides
Software
HALO			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
inForm			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
PerkinElmer Vectra			multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.
QuPath 0.3.2			intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.