파라핀 포매된 폐암 조직을 위한 다중 면역조직화학 염색

요약

이 실험 프로토콜은 주로 단일 채널 항체 배양 조건을 최적화하고 항체 및 채널의 설정을 조정하여 임상 기원 폐암 조직의 자가형광 및 채널 누화 문제를 해결함으로써 다중 면역조직화학(IHC) 염색 방법을 설명하고 최적화합니다.

초록

폐암은 전 세계적으로 악성 종양 관련 이환율 및 사망률의 주요 원인이며, 복잡한 종양 미세환경은 폐암 환자의 주요 사망 원인으로 여겨져 왔습니다. 종양 미세환경의 복잡성으로 인해 종양 조직의 세포 간 관계를 이해하기 위한 효과적인 방법이 필요합니다. 다중 면역조직화학(mIHC) 기술은 종양 조직에서 신호 전달 경로의 업스트림과 다운스트림 단백질 발현 간의 관계를 추론하고 임상 진단 및 치료 계획을 개발하기 위한 핵심 도구가 되었습니다. mIHC는 티라민 신호 증폭(TSA) 기술을 기반으로 하는 다중 표지 면역형광 염색 방법으로, 동일한 조직 절편 샘플에서 여러 표적 분자를 동시에 검출하여 서로 다른 단백질 동시 발현 및 공동 국소화 분석을 달성할 수 있습니다. 이 실험 프로토콜에서는 임상적 기원의 폐 편평 암종의 파라핀 포매 조직 절편을 다중 면역조직화학적 염색을 실시했습니다. 실험 프로토콜을 최적화함으로써 표지된 표적 세포 및 단백질의 다중 면역조직화학적 염색을 달성하여 폐 조직의 자가형광 및 채널 누화 문제를 해결했습니다. 또한 다중 면역조직화학 염색은 단일 세포 염기서열 분석, 단백질체학 및 조직 공간 염기서열 분석을 포함한 종양 관련 고처리량 염기서열 분석의 실험적 검증에 널리 사용되어 직관적이고 시각적인 병리학 검증 결과를 제공합니다.

서문

20년 이상의 역사를 가진 티라민 신호 증폭(TSA)은 고추냉이 과산화효소(HRP)를 사용하여 표적 항원의 고밀도 in situ 라벨링에 사용되는 분석 기법의 일종으로, 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA), 현장 혼성화(in situ hybridization, ISH), 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC) 및 기타 생물학적 항원 검출 기술에 널리 적용되고 있습니다. 검출된 신호의 감도를 실질적으로 향상시키는^{단계 1}. TSA 기술을 기반으로 한 오팔 다색 염색은 최근 개발되어 여러 연구에서 널리 사용되고^{있습니다 2,3,4,5}. 기존의 면역형광(IF) 염색은 연구자들에게 다양한 모델 유기체의 세포 및 조직 내 단백질 분포를 검출하고 비교할 수 있는 쉬운 도구를 제공합니다. 항체/항원 특이적 결합을 기반으로 하며 직접 및 간접 접근법을 포함한다⁶. 직접 면역염색은 관심 항원에 대한 형광단 접합 1차 항체를 사용하는 것을 포....

프로토콜

이 프로토콜은 중국 쓰촨 대학교 화경 병원 윤리 위원회의 지침에 의해 승인되었습니다. 폐암 조직 샘플은 West China Hospital의 폐암 센터에서 수술 중에 획득되었으며 각 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.

1. 조직 절편 준비

1. FFPE 준비
   1. 임상 조직을 중성 포르말린 용액에 72시간 이상 담그십시오.
   2. 크실렌과 등급이 매겨진 알코올 용액을 사용하여 조직을 탈수하는 과정을 완료하십시오²⁰.
   3. 4μm 절편 두께에서 수동 파라핀 포매 및 조직 절편을 수행합니다. 접착 현미경 슬라이드를 사용하여 조직 조각이 떨어지지 않도록 합니다.
   4. 슬라이드를 65°C의 오븐에서 2시간 동안 굽고 티슈와 슬라이드가 건조되도록 합니다. 실온의 슬라이드 박스에 보관하십시오.
2. 조직 절편 전처리
   1. 티슈 슬라이드를 65°C의 오븐에서 5분 동안 전처리한 후 2 x 15분 동안 크실렌 용액, 2 x 15분 동안 무수 에탄올 용액, 10분 동안 90% 에탄올 용액, 10분 동안 85% 에탄올 용액, 10분 동안 80% 에탄올 용액, 10분 동안 75% ....

토론

mIHC는 단일 조직 절편에서 단일 세포 수준에서 여러 단백질 마커의 정량적 및 공간적 분석을 위한 과학 연구 분야에서 없어서는 안될 실험 기법으로, 원래 조직의 맥락에서 상세한 조직 구조와 세포 상호 작용에 중점을 두어 질병 병리학 연구를 위한 직관적이고 정확한 데이터를 제공합니다. mIHC 기술이 널리 채택되려면 최적화되고 효과적인 실험 프로토콜이 필요합니다. 실험에서 발생할 수 있는.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Anti-CD8	Abcam	ab237709	Primary antibody, 1/100, PH9
Anti-CD68	Abcam	ab955	Primary antibody, 1/300, PH9
Anti-CK5/6	Millipore	MAB1620	Primary antibody, 1/150, PH9
Anti-HMGCS1	GeneTex	GTX112346	Primary antibody, 1/300, PH6
Animal nonimmune serum	MXB Biotechnologies	SP KIT-B3	Antigen blocking
Fluormount-G	SouthernBiotech	0100-01	Anti-fluorescent burst
Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit	Akoya	NEL861001KT	Opal mIHC Staining
Wash Buffer	Dako	K8000/K8002/K8007/K8023	Washing the tissues slides
Software
HALO			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
inForm			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
PerkinElmer Vectra			multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.
QuPath 0.3.2			intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.