تشوه كهربائي معدل السعة لتقييم التعب الميكانيكي للخلايا البيولوجية

Summary

يظهر هنا بروتوكول لاختبار التعب الميكانيكي في حالة خلايا الدم الحمراء البشرية باستخدام نهج التشوه الكهربائي المعدل السعة. يمكن استخدام هذا النهج العام لقياس التغيرات المنهجية في الخصائص المورفولوجية والميكانيكية الحيوية للخلايا البيولوجية في تعليق من التشوه الدوري.

Abstract

تشتهر خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) بتشوهها الملحوظ. يتعرضون مرارا وتكرارا لتشوه كبير عند المرور عبر دوران الأوعية الدقيقة. يظهر انخفاض التشوه في كرات الدم الحمراء المسنة من الناحية الفسيولوجية. لا يمكن بسهولة استخدام التقنيات الحالية لقياس تشوه الخلايا لقياس التعب ، والتدهور التدريجي في أغشية الخلايا الناجم عن الأحمال الدورية. نقدم بروتوكولا لتقييم التدهور الميكانيكي في كرات الدم الحمراء من إجهادات القص الدورية باستخدام التشوه الكهربائي القائم على تعديل مفتاح إزاحة السعة (ASK) في قناة الموائع الدقيقة. باختصار ، يتم إثارة الأقطاب الكهربائية المتداخلة في قناة الموائع الدقيقة بتيار متناوب منخفض الجهد عند ترددات الراديو باستخدام مولد إشارة. تستجيب كرات الدم الحمراء المعلقة للمجال الكهربائي وتظهر رحلان كهربائي إيجابي (DEP) ، والذي ينقل الخلايا إلى حواف القطب. ثم تتمدد الخلايا بسبب القوى الكهربائية التي تمارس على نصفي الخليتين ، مما يؤدي إلى تمدد أحادي المحور ، يعرف باسم التشوه الكهربائي. يمكن تعديل مستوى إجهاد القص والتشوه الناتج بسهولة عن طريق تغيير سعة موجة الإثارة. وهذا يتيح تحديد كميات التشوه غير الخطي لكرات الدم الحمراء استجابة للتشوهات الصغيرة والكبيرة عند الإنتاجية العالية. يؤدي تعديل موجة الإثارة باستخدام إستراتيجية ASK إلى حدوث تشوه كهربائي دوري بمعدلات تحميل وترددات قابلة للبرمجة. هذا يوفر طريقة مريحة لتوصيف التعب كرات الدم الحمراء. يتيح نهج التشوه الكهربائي المعدل ASK الخاص بنا ، لأول مرة ، قياسا مباشرا لإجهاد كرات الدم الحمراء من الأحمال الدورية. يمكن استخدامه كأداة للاختبار الميكانيكي الحيوي العام ، لتحليل تشوه الخلايا والتعب في أنواع الخلايا الأخرى والظروف المرضية ، ويمكن أيضا دمجه مع استراتيجيات للتحكم في البيئة المكروية للخلايا ، مثل توتر الأكسجين والإشارات البيولوجية والكيميائية.

Introduction

خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) هي أكثر الخلايا تشوها في جسم الإنسان¹. ترتبط قابليتها للتشوه ارتباطا مباشرا بوظائفها في حمل الأكسجين. تم العثور على انخفاض التشوه في كرات الدم الحمراء ليرتبط مع التسبب في العديد من اضطرابات كرات الدم^{الحمراء 2}. قادتنا قياسات التشوه إلى فهم أفضل للأمراض المرتبطة بكرات الدم الحمراء³. يمكن أن يختلف العمر الطبيعي لكرات الدم الحمراء من 70 إلى 140 يوما⁴. لذلك ، من المهم قياس كيفية انخفاض قابليتها للتشوه جنبا إلى جنب مع عملية الشيخوخة ، على سبيل المثال ، سلوك التعب بسبب إجهادات القص الدورية³.

Protocol

تم الحصول على الدم البشري الكامل غير المحدد تجاريا. وأجري العمل المتعلق بعينات الدم في مختبر من المستوى 2 للسلامة الأحيائية باستخدام البروتوكولات التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية للسلامة الأحيائية في جامعة فلوريدا أتلانتيك.

1. إعداد جهاز الموائع الدقيقة

1. قم بلصق رقاقة السيليكون الرئيسية SU-8 لتصميم قناة الموائع الدقيقة داخل طبق بتري بلاستيكي مقاس 14 سم وقم بتنظيفه بغاز N₂ .
2. تزن 60 جم من قاعدة polydimethylsiloxane (PDMS) و 6 جم من عامل معالجة PDMS في كوب ورقي. اخلطي الجزأين باستخدام ملعقة خشبية حتى يصبح الخليط أبيض غائم.
3. صب خليط PDMS في طبق بتري البلاستيكي الذي يحتوي على رقاقة السيليكو....

النتائج

عندما تم تحميل تعليق الخلية في قناة الموائع الدقيقة ، لوحظ توزيع موحد نسبيا للخلايا. عند خرج الإشارة (على سبيل المثال ، موجة جيبية بسيطة أو مرحلة On-Keying من ASK) من مولد الوظائف ، ولدت الأقطاب الكهربائية ذات الأغشية الرقيقة المتداخلة مجالا كهربائيا غير منتظم للتيار المتردد. استجابت الخلايا ال?.......

Discussion

يمكن استخدام تعديل ASK OOK لموجة جيبية تحفز قوة DEP لاختبار التعب الميكانيكي لكرات الدم الحمراء على مدى فترة طويلة من الزمن. في هذا البروتوكول ، قصرنا اختبار التعب في المختبر على 1 ساعة لمنع الآثار الأيضية الضارة المحتملة على تشوه الخلية. يمكن برمجة ظروف اختبار التعب الشاملة باستخدام تقنية الت.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance Scale	ViBRA	HT-224R
Bandpass filter	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL	Fisher Scientific	14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm	Fisher Scientific	12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm	Fisher Scientific	12-460-407	1.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gauge	BSTEAN	X001308N97
Bovin Serum Albumin	RMBIO	BSA-BSH
Centrifuge	SCILOGEX	911015119999
Conical Tube, 50 mL	Fisher Scientific	05-539-13
Dextrose	Fisher Scientific	MDX01455	MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meter	ecoTestr	358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubes	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft		Graph plotting
Function Generator	SIGLENT	SDG830
Glass/ITO Electrode Substrate	OSSILA	S161
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted Microscope	OLYMPUS	IX81 - SN9E07015
Lab Oven	QUINCY LAB (QL)	MODEL 30GCE	Digital Model
Matlab	MathWorks		Graph plotting
Micro Osmometer - Model 3300	Advanced Instruments Inc.	S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping Film	Fisher Scientific	13-374-12
Petri dish	FALCON	SKU=351006	ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)	LONZA	04-479Q
Plasma Cleaner	Harrick plasma PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		CAD software
Sucrose	Fisher Scientific	50-188-2419
Vacuum Desiccator	SPBEL-ART	F42400-2121
Wooden spatula	Fisher Scientific	NC0304136	Tongue Depressors Wood NS 6"