생물학적 세포의 기계적 피로를 평가하기 위한 진폭 변조 전형성

요약

여기에 제시된 프로토콜은 진폭 변조 전극 형성 접근법을 사용하는 인간 적혈구의 경우 기계적 피로 테스트를 위한 프로토콜입니다. 이러한 일반적인 접근법은 순환 변형으로부터 현탁액에서 생물학적 세포의 형태학적 및 생체역학적 특성의 체계적인 변화를 측정하는 데 사용될 수 있습니다.

초록

적혈구(RBC)는 놀라운 변형성으로 유명합니다. 그들은 미세 순환을 통과 할 때 반복적으로 상당한 변형을 겪습니다. 감소된 변형성은 생리학적으로 노화된 적혈구에서 볼 수 있습니다. 세포 변형성을 측정하는 기존의 기술은 피로, 주기적 부하에 의해 유발되는 세포막의 점진적인 분해를 측정하는 데 쉽게 사용할 수 없습니다. 우리는 미세유체 채널에서 진폭 편이 키잉(ASK) 변조 기반 전출을 사용하여 주기적 전단 응력으로 인한 적혈구의 기계적 열화를 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 간단히 말해서, 미세유체 채널 내의 인터디지팅된 전극들은 신호 발생기를 사용하여 무선 주파수에서 저전압 교류로 여기된다. 현탁액의 적혈구는 전기장에 반응하고 세포를 전극 가장자리로 이동시키는 양성 전동영동(DEP)을 나타냅니다. 그런 다음 두 셀 반쪽에 가해지는 전기력으로 인해 셀이 늘어나 전극 형성으로 알려진 단축 스트레칭이 발생합니다. 전단 응력의 수준과 그에 따른 변형은 여기파의 진폭을 변경하여 쉽게 조정할 수 있습니다. 이를 통해 높은 처리량에서 크고 작은 변형에 대한 반응으로 RBC의 비선형 변형성을 정량화할 수 있습니다. ASK 전략으로 여기파를 수정하면 프로그래밍 가능한 로딩 속도와 주파수로 순환 전극 형성이 유도됩니다. 이는 RBC 피로의 특성화를 위한 편리한 방법을 제공합니다. 당사의 ASK 변조 전극 형성 접근법은 처음으로 주기적 하중으로 인한 RBC 피로를 직접 측정할 수 있게 해줍니다. 다른 세포 유형 및 질병 조건에서 세포 변형성 및 피로를 분석하기 위한 일반적인 생체역학적 테스트를 위한 도구로 사용할 수 있으며 산소 장력 및 생물학적 및 화학적 신호와 같은 세포의 미세 환경을 제어하는 전략과 결합할 수도 있습니다.

서문

적혈구(RBC)는 인체에서 가장 변형되기 쉬운 세포입니다¹. 변형성은 산소 운반 기능과 직접적인 관련이 있습니다. 적혈구의 감소된 변형성은 여러 적혈구 장애의 발병기전과 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다². 변형성 측정을 통해 적혈구 관련 질병에 대한 더 나은 이해를 얻을 수 있었습니다³. 적혈구의 정상 수명은 70일에서 140일까지 다양하다⁴. 그러므로, 노화 과정에 따라 변형성이 어떻게 감소하는지, 예를 들어 주기적 전단 응력으로 인한 피로 거동을 측정하는 것이 중요하다³.

높은 처리량에서 RBC 변형성을 측정하는 것은 개별 셀에 적용되는 피코네톤 스케일 힘(~^10-12 N) 때문에 어렵습니다. 지난 10년 동안 세포 변형성을 측정하기 위한 많은 기술들이 개발되었다⁵. 단일 세포 수준에서 적혈구의 변형 측정은 피펫 흡인 및 광학 핀셋으로 수행할 수 있으며, 벌크 분석은 삼투압 구배 ektacytometry로 수행할 수 있습니다. Ektacytometry 분석은 혈액 질환을 진단 할 수있는 기회를 제공하는 풍부한 데이터를 제공합니다 ^6,7. 적혈구의 변형성은 콜로이드 프로브 원자력 현미경에 의한 점탄성 이론을 사용하여 분석할 수도 있습니다. 이 방법에서는 시간 종속 응답과 정상 상태 응답을 모두 고려하여 RBC의 탄성 계수를 추정하기 위해 계산 분석이 적용됩니다. 개별 적혈구의 변형성은 단일 셀 마이크로챔버 어레이 방법을 사용하여 측정할 수 있습니다. 이 방법은 혈액학적 장애를 검출하기 위해 복잡한 적혈구 집단에서 RBC 변형성 및 세포 특성의 분포에 대한 정보를 제공하기 위해 막 및 세포질 형광 마커를 통해 각 세포를 분석한다⁸.

피로는 엔지니어링 재료 및 생체 재료의 특성 저하의 핵심 요소입니다. 피로 시험은 주기적 하중을 받는 구조물의 무결성과 수명에 대한 정량적 해석을 가능하게 합니다. 생물학적 세포에서의 피로 분석은 세포막에서 순환 변형을 구현하기 위한 일반적이고 쉽게 적용할 수 있는 높은 처리량 및 정량적 방법의 부족으로 인해 오랫동안 방해를 받아 왔습니다. 이것은 미세 유체 설정에서 구현된 전기 신호 변조 및 전기 형성 기술의 활용으로 가능합니다. 디지털 변조로서의 ASK(Amplitude Shift Keying) 기술은 이 기사에서 OOK(On-Off Keying) 변조를 통해 적용됩니다. 키잉(keying)의 개념은 채널을 통해 디지털 신호를 전송하는 것을 말하며, 이를 위해서는 사인파 반송파 신호가 작동해야 한다⁽⁹). ON과 OFF 시간을 동일하게 설정할 수 있습니다. ON-keying에서 RBC는 불균일한 전기장에 의해 생성된 외부 전기력(_Fdep)¹⁰ 에 노출되는 동안 변형된 상태로 들어갑니다. 오프 키잉(OFF-keying)에서 RBC는 완화된 상태에 있습니다. 우리는 적혈구의 피로, 즉 로딩 주기가 증가함에 따라 늘어나는 능력의 점진적인 저하를 관찰합니다. 적혈구의 피로로 인한 변형성 손실은 혈액 순환 중 축적된 막 손상에 대한 통찰력을 제공하여 세포 피로와 질병 상태 사이의 연관성을 추가로 조사할 수 있도록 합니다.

여기에서는 ASK 변조 전착을 통해 미세 유체 장치에서 적혈구의 피로 테스트를 구현하는 방법과 미세 유체 장치, 기계적 하중 및 적혈구의 기계적 변형성의 점진적인 저하 특성화를 위한 미세 유체 장치, 기계적 하중 및 미세 상상과 같은 시스템 설정에 대한 단계별 절차를 제공합니다.

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프로토콜

비식별화된 인간 전혈을 상업적으로 입수하였다. 혈액 샘플과 관련된 작업은 플로리다 애틀랜틱 대학의 기관 생물 안전위원회에서 승인 한 프로토콜을 사용하여 생물 안전 레벨 2 실험실에서 수행되었습니다.

1. 미세 유체 장치 준비

1. 플라스틱 8cm 페트리 접시 내부의 미세 유체 채널 설계를 위해 SU-14 마스터 실리콘 웨이퍼를 테이프로 붙이고 N₂ 가스로 청소합니다.
2. 종이컵에 폴리디메틸실록산(PDMS) 베이스 60g과 PDMS 경화제 6g을 계량합니다. 혼합물이 흐린 흰색이 될 때까지 나무 주걱을 사용하여 두 부분을 섞습니다.
3. PDMS 혼합물을 실리콘 웨이퍼가 들어 있는 플라스틱 페트리 접시에 붓습니다. 페트리 접시를 3방향 마개가 있는 진공 건조기에 넣습니다. 마개의 밸브를 돌려 진공을 데시케이터 챔버에 연결하여 PDMS에서 기포를 제거합니다.
4. 약 5분 주기로 데시케이터 챔버를 주변 환경에 연결하기 위해 스톱콕 밸브를 조정하여 데시케이터 챔버에 공기를 다시 유입합니다. 채널의 기능에서 모든 기포가 제거될 때까지 반복합니다.
5. 페트리 접시를 70°C의 오븐에 4시간 동안 넣습니다. 시간이 지나면 페트리 접시를 꺼내 실온으로 식힌 다음 커팅 매트 위에 놓습니다.
6. 메스를 사용하여 실리콘 웨이퍼 위의 PDMS 부분을 잘라냅니다. 랩랩 랩핑 필름의 두 장 사이에 컷아웃 PDMS를 놓습니다. 마이크로채널의 움푹 들어간 곳과 반투명 필름 사이에 형성된 갭은 미세유체 채널의 위치뿐만 아니라 각각의 입구 및 출구의 식별을 용이하게 합니다.
7. 면도날을 사용하여 대형 PDMS에서 개별 채널을 잘라냅니다. 두 가지 크기에 맞는 생검 펀치를 사용하여 3mm 입구 구멍과 1.5mm 출구 구멍을 펀칭합니다(그림 1A).
8. 구멍이 뚫린 채널을 채널 면이 위를 향하도록 하여 깨끗한 유리 슬라이드 위에 놓습니다. 박막 ITO(인듐 주석 산화물) 인터디지타이징 전극이 포함된 20mm x 15mm 유리 기판을 전극이 위를 향하도록 하여 동일한 유리 슬라이드에 놓습니다.
9. PDMS와 기판이 있는 유리 슬라이드를 플라즈마 클리너에 부드럽게 넣습니다. 가스 밸브를 닫고 펌프 스위치를 켠 다음 2 - 600 mTorr의 센서 판독값을 얻을 때까지 800분 동안 기다립니다.
10. 전원 스위치를 켜고 30초 동안 기다립니다. RF 전원 노브를 낮음에서 높음으로 돌리고 1분 동안 기다립니다.
11. 그런 다음 RF 노브를 낮게, 전원 스위치를 OFF로, 펌프 스위치를 OFF로 돌리고 가스 밸브를 열어 순서를 반대로 합니다.
12. 플라즈마 청소기의 챔버를 연 직후 채널 쪽이 아래(180°)를 향하도록 PDMS를 들어 올려 회전시킵니다. ITO 기판 상단에 채널을 놓습니다. 본딩 과정이 시작되었습니다.
13. 핀셋을 사용하여 PDMS의 모서리를 약 3초 동안 부드럽게 누릅니다. 채널 자체를 누르지 마십시오.
    알림: 접합 과정은 처리된 두 표면 사이의 물리적 접촉 시 자발적으로 발생합니다.
14. 프라이밍 배지를 23G 바늘이 있는 1mL 주사기에 넣습니다. 바늘을 입구 웰에 똑바로 삽입한 다음 매체를 분리하여 채널을 조심스럽게 적십니다. 천천히 작동하십시오. 기포를 넣지 마십시오. 최소 3분 동안 배양합니다.
15. 10 μL 피펫 팁을 사용하여 프라임 배지를 제거합니다. DEP 매체를 채널에 삽입하여 DEP 매체로 채널을 3회 세척합니다. 채널을 항상 젖은 상태로 유지하십시오.

2. 테스트 픽스처

참고: 테스트 픽스처는 3D CAD 소프트웨어를 사용하여 설계되었으며 기본 하우징 유닛과 상단 유닛을 포함합니다(그림 1B). 그런 다음 표준 공차 한계가 약 ± 0.005 인치 치수 인 3 축 CNC 밀링 머신을 사용하여 전자 캘리퍼 (도시되지 않음)를 사용하여 검사합니다. 고정물의 무균성은 체외 생체역학적 테스트를 위해 요구되지 않는다.

1. 두 세트의 스프링 피스톤 커넥터의 납땜 컵 끝에 와이어를 미리 납땜합니다.
2. 스프링 피스톤 커넥터를 상단 장치에 삽입하고 에폭시 접착제 한 방울을 추가하여 영구적인 접착을 만듭니다.

3. 전착작업완충액의 제조

1. DEP 배지를 준비하려면 저울을 사용하여 자당 12.75g과 포도당 0.45g의 무게를 잰다.
2. 두 분말을 150mL의 탈이온수(DI)와 3.5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)가 담긴 단일 용기에 녹입니다.
3. 저범위 전도도 테스터를 사용하여 전도도를 측정하고 전도도가 0.04S/m인지 확인합니다(그림 2).
   알림: 결과 DEP 힘¹¹의 부호와 크기를 변경할 수 있는 다른 전도도 값을 사용할 수 있습니다. 그러나 전착에는 양의 DEP 힘이 필요합니다.
4. 삼투압계를 사용하여 삼투압이 혈장의 정상 범위인 275 - 295 mOsm/kg 내에 있는지 확인합니다(그림 3). 4 °C에서 보관하십시오. 이제 DEP 매체가 준비되었습니다.
5. 15mL 튜브에서 0.5g의 소혈청알부민(BSA)을 DEP 배지 10mL에 녹입니다. 철저히 섞는다. 이제 장치의 주요 매체가 준비되었습니다.

4. 세포 현탁액의 제조

1. 268 x g 에서 3분 동안 1mL의 PBS로 혈액을 원심분리하여 전혈 20μL를 세척합니다. 상청액을 버리십시오.
2. 적혈구를 PBS 1mL에 재현탁합니다. 부드럽게 피펫으로 섞습니다. 적혈구를 268 x g 에서 3분 동안 세척하고 상층액을 버립니다.
3. 10 μL 마이크로피펫 팁을 사용하여 5 μL의 RBC 펠릿을 추출하고 1 mL의 DEP 배지에 완전히 분주합니다. 268 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 세척합니다.
4. 상층액을 버리고 적혈구를 DEP 배지 1mL에 재현탁합니다. 부드럽게 피펫으로 섞습니다.
5. 적혈구를 268 x g 에서 3분 동안 세척하고 상층액을 버립니다. 2 μL의 RBC 펠릿을 500 μL의 DEP 배지에 피펫팅합니다. 세포 현탁액은 이제 62 - 104 cells/μL¹² 범위 내의 농도로 준비되며, 이는 표준 세포 계수 슬라이드를 사용하여 확인할 수 있습니다.

5. 전착 설정 및 피로 시험

1. 미세 유체 장치를 테스트 픽스처의 바닥 부분에 놓습니다. 고정 장치의 상단 부분을 장치에 맞추고 두 세트의 나일론 나사와 너트를 사용하여 두 부품을 조립합니다(그림 4).
2. 테스트 픽스처를 현미경 스테이지에 놓습니다. 현미경으로 원하는 전극 세트를 찾습니다.
3. 배치된 전극 세트와 일치하는 해당 전극 와이어 쌍을 함수 발생기의 출력 단자에 연결합니다(그림 4).
4. 미세유체 채널의 3mm 입구에서 DEP 배지 5μL를 제거합니다. 10 μL 피펫 팁을 사용하여 5 μL의 세포 현탁액을 입구에 천천히 로드합니다.
5. 세포가 1분 동안 가라앉도록 합니다. 필요한 경우 입구에 DEP 매체를 추가하여 셀을 채널로 밀어 넣습니다.
6. 20x 배율로 채널을 관찰하십시오. 414/46nm 대역통과 필터를 사용하여 이미징의 대비를 향상시킵니다.
7. Sine 버튼을 누르고 3MHz 주파수에서 2V_RMS 진폭으로 사인파를 정의합니다. Mod 버튼을 눌러 변조를 활성화합니다. Type 옵션을 눌러 웨이브 모드를 ASK로 변경합니다.
8. 변조 주파수를 250mHz로 설정하며, 이는 4초의 로딩-언로딩 기간에 해당합니다(그림 5A). 함수 생성기의 출력을 켭니다.
9. 초당 30프레임(fps)으로 10분마다 1분 분량의 비디오를 녹화합니다.

6. RBC 변형의 특성화

1. 비디오 편집 응용 프로그램을 사용하여 Ctrl+O를 눌러 이전 단계에서 녹화한 .avi 파일을 엽니다. 타임라인을 사용하여 원하는 프레임을 선택하고 키보드에서 Home 키를 누른 다음 End 키를 눌러 선택 시작 프레임과 끝 프레임을 동일하게 설정합니다.
2. 이미지 프레임을 내보냅니다. 출력 형식을 JPEG 로 선택하고 OK를 누릅니다.
3. ImageJ 응용 프로그램을 열고 이전 단계에서 저장한 이미지를 로드합니다. 먼저 분석(Analyze) > 측정 설정(Set Measurements )을 누르고 영역(Area), 둘레(Perimeter) 및 타원 맞춤(Fit Ellipse ) 확인란이 선택되어 있는지 확인합니다. OK를 누릅니다.
4. 그런 다음 이미지 > 유형 > 8비트를 선택하여 이미지를 회색조로 변환합니다.
5. 그런 다음 Image > Adjust > Thresholding을 사용하여 이미지를 바이너리로 변환합니다. [임계값] 대화 상자에서 필요에 따라 두 개의 슬라이더를 조정합니다. Apply 키를 누른 다음 Threshold(임계값) 대화 상자를 닫습니다.
6. [Analyze > Tools > ROI Manager]를 선택합니다. ROI 관리자에서 Show All(모두 표시) 확인란을 누릅니다. 이 상자를 닫지 마십시오.
7. [지팡이(추적) 도구]를 선택하고 이미지에서 적용 가능한 셀을 선택한 다음 키보드에서 T 키를 누릅니다. 선택한 셀에 번호가 매겨집니다. 새 셀을 다시 선택할 수 있습니다. 측정할 적용 가능한 모든 셀을 선택합니다. 적용 가능한 세포는 다른 세포로부터 분리된 세포로 식별됩니다. 이러한 셀의 수는 단일 시야에서 50에서 200까지 다양할 수 있습니다.
8. ROI 관리자 상자로 돌아가서 측정을 누릅니다. 그러면 결과 상자가 열립니다. Major와 Minor라는 레이블이 붙은 열은 각각 피팅된 타원 주 축과 보조 축의 길이(픽셀 단위)입니다. 파일(File) > 다른 이름으로 저장(Save As )을 선택하여 측정값을 CSV 형식 파일로 내보냅니다.
9. 적절한 계산 분석 소프트웨어를 사용하여 메이저와 마이너의 몫을 계산합니다.

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결과

세포 현탁액이 미세유체 채널에 로딩되었을 때, 세포의 비교적 균일한 분포가 관찰되었다. 함수 발생기에서 신호 출력(예: 간단한 사인파 또는 ASK의 온키잉 위상)이 발생하면 박막 인터디지타이티드 전극은 불균일한 교류 전기장을 생성합니다. 부유 세포는 이 전기적 여기에 자발적으로 반응하여 긍정적인 DEP 거동, 즉 더 높은 전계 강도를 가진 전극의 가장자리를 향해 이동하는 것을 나타냈습니?...

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토론

DEP 힘 유도 사인파의 ASK OOK 변조는 장기간에 걸쳐 적혈구의 기계적 피로를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 세포 변형성에 대한 잠재적인 대사 부작용을 방지하기 위해 시험관 내 피로 테스트를 1시간으로 제한했습니다. 포괄적인 피로 시험 조건은 ASK 변조 전착 기술을 사용하여 프로그래밍할 수 있습니다. 로딩 주파수, 진폭 및 로딩 속도와 같은 파라미터를 모두 프로그래?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance Scale	ViBRA	HT-224R
Bandpass filter	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL	Fisher Scientific	14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm	Fisher Scientific	12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm	Fisher Scientific	12-460-407	1.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gauge	BSTEAN	X001308N97
Bovin Serum Albumin	RMBIO	BSA-BSH
Centrifuge	SCILOGEX	911015119999
Conical Tube, 50 mL	Fisher Scientific	05-539-13
Dextrose	Fisher Scientific	MDX01455	MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meter	ecoTestr	358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubes	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft		Graph plotting
Function Generator	SIGLENT	SDG830
Glass/ITO Electrode Substrate	OSSILA	S161
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted Microscope	OLYMPUS	IX81 - SN9E07015
Lab Oven	QUINCY LAB (QL)	MODEL 30GCE	Digital Model
Matlab	MathWorks		Graph plotting
Micro Osmometer - Model 3300	Advanced Instruments Inc.	S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping Film	Fisher Scientific	13-374-12
Petri dish	FALCON	SKU=351006	ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)	LONZA	04-479Q
Plasma Cleaner	Harrick plasma PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		CAD software
Sucrose	Fisher Scientific	50-188-2419
Vacuum Desiccator	SPBEL-ART	F42400-2121
Wooden spatula	Fisher Scientific	NC0304136	Tongue Depressors Wood NS 6"