Amplitudenmodulierte Elektrodeformation zur Bewertung der mechanischen Ermüdung biologischer Zellen

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll für mechanische Ermüdungstests bei menschlichen roten Blutkörperchen unter Verwendung eines amplitudenmodulierten Elektrodeformationsansatzes vorgestellt. Dieser allgemeine Ansatz kann verwendet werden, um die systematischen Veränderungen der morphologischen und biomechanischen Eigenschaften biologischer Zellen in einer Suspension aus zyklischer Verformung zu messen.

Zusammenfassung

Rote Blutkörperchen (RBCs) sind für ihre bemerkenswerte Verformbarkeit bekannt. Sie erleiden beim Durchlaufen der Mikrozirkulation immer wieder erhebliche Verformungen. Bestehende Techniken zur Messung der Zellverformbarkeit können nicht ohne weiteres zur Messung der Ermüdung, d. h. des allmählichen Abbaus von Zellmembranen, der durch zyklische Belastungen verursacht wird, verwendet werden. Wir stellen ein Protokoll vor, um die mechanische Degradation in Erythrozyten durch zyklische Scherspannungen unter Verwendung der auf Amplitudenverschiebung (ASK) basierenden elektrodischen Verformung in einem mikrofluidischen Kanal zu bewerten. Kurz gesagt, werden die interdigitalisierten Elektroden im mikrofluidischen Kanal mit einem Niederspannungs-Wechselstrom bei Radiofrequenzen unter Verwendung eines Signalgenerators angeregt. Erythrozyten in Suspension reagieren auf das elektrische Feld und weisen eine positive Dielektrophorese (DEP) auf, die Zellen an die Elektrodenränder bewegt. Die Zellen werden dann aufgrund der elektrischen Kräfte, die auf die beiden Zellhälften ausgeübt werden, gedehnt, was zu einer einachsigen Dehnung führt, die als Elektroverformung bezeichnet wird. Die Höhe der Schubspannung und die daraus resultierende Verformung können einfach durch Änderung der Amplitude der Anregungswelle eingestellt werden. Dies ermöglicht Quantifizierungen der nichtlinearen Verformbarkeit von Erythrozyten als Reaktion auf kleine und große Verformungen bei hohem Durchsatz. Die Modifikation der Anregungswelle mit der ASK-Strategie induziert eine zyklische Elektrodeformation mit programmierbaren Belastungsraten und Frequenzen. Dies bietet eine bequeme Möglichkeit zur Charakterisierung der Erythrozytenermüdung. Unser ASK-modulierter Elektrodeformationsansatz ermöglicht erstmals eine direkte Messung der Erythrozytenermüdung durch zyklische Belastungen. Es kann als Werkzeug für allgemeine biomechanische Tests, für Analysen der Zellverformbarkeit und -ermüdung bei anderen Zelltypen und Krankheitszuständen verwendet werden und kann auch mit Strategien zur Kontrolle der Mikroumgebung von Zellen kombiniert werden, wie z. B. Sauerstoffspannung und biologische und chemische Hinweise.

Einleitung

Rote Blutkörperchen (RBCs) sind die am stärksten verformbaren Zellen im menschlichen Körper¹. Ihre Verformbarkeit steht in direktem Zusammenhang mit ihrer sauerstofftransportierenden Funktionalität. Es wurde festgestellt, dass eine reduzierte Verformbarkeit von Erythrozyten mit der Pathogenese verschiedener Erythrozytenerkrankungen korreliert². Verformbarkeitsmessungen haben uns zu einem besseren Verständnis von Erythrozyten-assoziierten Erkrankungen geführt³. Die normale Lebensdauer von Erythrozyten kann zwischen 70 und 140 Tagen^{variieren 4}. Daher ist es wichtig zu messen,....

Protokoll

Deidentifiziertes menschliches Vollblut wurde kommerziell gewonnen. Die Arbeit mit den Blutproben wurde in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 unter Verwendung von Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Biosafety Committee an der Florida Atlantic University genehmigt wurden.

1. Vorbereitung des mikrofluidischen Geräts

1. Klebe den SU-8 Master-Siliziumwafer für das mikrofluidische Kanaldesign auf der Innenseite einer 14 cm großen Petrischale aus Kunststoff ab und reinige ihn mit N₂ Gas.
2. 60 g Polydimethylsiloxan (PDMS) Base und 6 g PDMS-Härter in einen Pappbecher wiegen. Mischen Sie die ....

Diskussion

Die ASK OOK-Modulation einer DEP-Kraft-induzierenden Sinuswelle kann verwendet werden, um die mechanische Ermüdung von Erythrozyten über einen langen Zeitraum zu testen. In diesem Protokoll haben wir die In-vitro-Ermüdungstests auf 1 Stunde begrenzt, um mögliche nachteilige metabolische Auswirkungen auf die Verformbarkeit der Zellen zu verhindern. Umfassende Ermüdungsprüfbedingungen können mit der ASK-modulierten Elektroverformungstechnik programmiert werden. Parameter wie Belastungsfrequenz, Amplitude und Belastu.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance Scale	ViBRA	HT-224R
Bandpass filter	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL	Fisher Scientific	14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm	Fisher Scientific	12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm	Fisher Scientific	12-460-407	1.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gauge	BSTEAN	X001308N97
Bovin Serum Albumin	RMBIO	BSA-BSH
Centrifuge	SCILOGEX	911015119999
Conical Tube, 50 mL	Fisher Scientific	05-539-13
Dextrose	Fisher Scientific	MDX01455	MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meter	ecoTestr	358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubes	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft		Graph plotting
Function Generator	SIGLENT	SDG830
Glass/ITO Electrode Substrate	OSSILA	S161
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted Microscope	OLYMPUS	IX81 - SN9E07015
Lab Oven	QUINCY LAB (QL)	MODEL 30GCE	Digital Model
Matlab	MathWorks		Graph plotting
Micro Osmometer - Model 3300	Advanced Instruments Inc.	S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping Film	Fisher Scientific	13-374-12
Petri dish	FALCON	SKU=351006	ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)	LONZA	04-479Q
Plasma Cleaner	Harrick plasma PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		CAD software
Sucrose	Fisher Scientific	50-188-2419
Vacuum Desiccator	SPBEL-ART	F42400-2121
Wooden spatula	Fisher Scientific	NC0304136	Tongue Depressors Wood NS 6"