Amplitudenmodulierte Elektrodeformation zur Bewertung der mechanischen Ermüdung biologischer Zellen

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll für mechanische Ermüdungstests bei menschlichen roten Blutkörperchen unter Verwendung eines amplitudenmodulierten Elektrodeformationsansatzes vorgestellt. Dieser allgemeine Ansatz kann verwendet werden, um die systematischen Veränderungen der morphologischen und biomechanischen Eigenschaften biologischer Zellen in einer Suspension aus zyklischer Verformung zu messen.

Zusammenfassung

Rote Blutkörperchen (RBCs) sind für ihre bemerkenswerte Verformbarkeit bekannt. Sie erleiden beim Durchlaufen der Mikrozirkulation immer wieder erhebliche Verformungen. Bestehende Techniken zur Messung der Zellverformbarkeit können nicht ohne weiteres zur Messung der Ermüdung, d. h. des allmählichen Abbaus von Zellmembranen, der durch zyklische Belastungen verursacht wird, verwendet werden. Wir stellen ein Protokoll vor, um die mechanische Degradation in Erythrozyten durch zyklische Scherspannungen unter Verwendung der auf Amplitudenverschiebung (ASK) basierenden elektrodischen Verformung in einem mikrofluidischen Kanal zu bewerten. Kurz gesagt, werden die interdigitalisierten Elektroden im mikrofluidischen Kanal mit einem Niederspannungs-Wechselstrom bei Radiofrequenzen unter Verwendung eines Signalgenerators angeregt. Erythrozyten in Suspension reagieren auf das elektrische Feld und weisen eine positive Dielektrophorese (DEP) auf, die Zellen an die Elektrodenränder bewegt. Die Zellen werden dann aufgrund der elektrischen Kräfte, die auf die beiden Zellhälften ausgeübt werden, gedehnt, was zu einer einachsigen Dehnung führt, die als Elektroverformung bezeichnet wird. Die Höhe der Schubspannung und die daraus resultierende Verformung können einfach durch Änderung der Amplitude der Anregungswelle eingestellt werden. Dies ermöglicht Quantifizierungen der nichtlinearen Verformbarkeit von Erythrozyten als Reaktion auf kleine und große Verformungen bei hohem Durchsatz. Die Modifikation der Anregungswelle mit der ASK-Strategie induziert eine zyklische Elektrodeformation mit programmierbaren Belastungsraten und Frequenzen. Dies bietet eine bequeme Möglichkeit zur Charakterisierung der Erythrozytenermüdung. Unser ASK-modulierter Elektrodeformationsansatz ermöglicht erstmals eine direkte Messung der Erythrozytenermüdung durch zyklische Belastungen. Es kann als Werkzeug für allgemeine biomechanische Tests, für Analysen der Zellverformbarkeit und -ermüdung bei anderen Zelltypen und Krankheitszuständen verwendet werden und kann auch mit Strategien zur Kontrolle der Mikroumgebung von Zellen kombiniert werden, wie z. B. Sauerstoffspannung und biologische und chemische Hinweise.

Einleitung

Rote Blutkörperchen (RBCs) sind die am stärksten verformbaren Zellen im menschlichen Körper¹. Ihre Verformbarkeit steht in direktem Zusammenhang mit ihrer sauerstofftransportierenden Funktionalität. Es wurde festgestellt, dass eine reduzierte Verformbarkeit von Erythrozyten mit der Pathogenese verschiedener Erythrozytenerkrankungen korreliert². Verformbarkeitsmessungen haben uns zu einem besseren Verständnis von Erythrozyten-assoziierten Erkrankungen geführt³. Die normale Lebensdauer von Erythrozyten kann zwischen 70 und 140 Tagen^{variieren 4}. Daher ist es wichtig zu messen, wie ihre Verformbarkeit mit dem Alterungsprozess abnimmt, z. B. ihr Ermüdungsverhalten aufgrund zyklischer Scherspannungen³.

Die Messung der Verformbarkeit von Erythrozyten bei hohem Durchsatz ist aufgrund der Piconewton-Skalenkräfte (~^10-12 N), die auf die einzelnen Zellen ausgeübt werden, eine Herausforderung. In den letzten zehn Jahren wurden viele Technologien entwickelt, um die Verformbarkeit von Zellen zu messen⁵. Deformationsmessungen von Erythrozyten auf Einzelzellebene können durch Pipettenaspiration und optische Pinzette durchgeführt werden, während Massenanalysen durch osmotische Gradientenektazytometrie durchgeführt werden. Ektazytometrische Analysen liefern eine Fülle von Daten, die die Möglichkeit bieten, Bluterkrankungen zu diagnostizieren ^6,7. Die Verformbarkeit von Erythrozyten kann auch mit Hilfe der viskoelastischen Theorie mittels Kolloidsonden-Rasterkraftmikroskopie analysiert werden. Bei dieser Methode wird eine computergestützte Analyse angewendet, um den Elastizitätsmodul von Erythrozyten zu schätzen, wobei sowohl zeitabhängige als auch stationäre Antworten berücksichtigt werden. Die Verformbarkeit einzelner Erythrozyten kann mit der Einzelzell-Mikrokammer-Array-Methode gemessen werden. Diese Methode analysiert jede Zelle durch die Membran und zytosolische Fluoreszenzmarker, um Informationen über die Verformbarkeit von Erythrozyten und die Verteilung zellulärer Eigenschaften in komplexen Erythrozytenpopulationen zu erhalten, um hämatologische Erkrankungen zu erkennen⁸.

Ermüdung ist ein Schlüsselfaktor für die Verschlechterung der Eigenschaften von technischen Materialien und Biomaterialien. Die Ermüdungsprüfung ermöglicht eine quantitative Analyse der Integrität und Langlebigkeit einer Struktur, die einer zyklischen Belastung ausgesetzt ist. Die Analyse der Ermüdung in biologischen Zellen wurde lange Zeit durch das Fehlen einer allgemeinen, leicht anwendbaren, quantitativen Methode für den hohen Durchsatz und die Implementierung zyklischer Deformation in Zellmembranen behindert. Dies ist durch den Einsatz von elektrischen Signalmodulations- und Elektrodeformationstechniken möglich, die in einer mikrofluidischen Umgebung implementiert sind. Die ASK-Technik (Amplitude Shift Keying) als digitale Modulation wird in diesem Artikel durch die On-Off-Keying-Modulation (OOK) angewendet. Das Konzept der Kodierung bezieht sich auf die Übertragung digitaler Signale über den Kanal, der ein Sinuswellenträgersignal benötigt, um 9^{zu funktionieren.} Die Ein- und Ausschaltzeiten können gleich eingestellt werden. Unter EIN-Tasten treten Erythrozyten in einen verformten Zustand über, während sie einer externen Elektroformkraft (F_dep)¹⁰ ausgesetzt sind, die durch das ungleichmäßige elektrische Feld erzeugt wird. Unter OFF-Keying befinden sich RBCs in ihrem entspannten Zustand. Wir beobachten die Ermüdung von Erythrozyten, d.h. eine fortschreitende Verschlechterung ihrer Dehnungsfähigkeit mit zunehmender Belastungszyklen. Der ermüdungsbedingte Verlust der Verformbarkeit von Erythrozyten kann Einblicke in die akkumulierte Membranschädigung während der Blutzirkulation geben, so dass wir die Zusammenhänge zwischen Zellermüdung und Krankheitszuständen weiter untersuchen können.

Hier stellen wir Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Verfügung, wie die Ermüdungsprüfung von Erythrozyten in einem mikrofluidischen Gerät über ASK-modulierte Elektroverformung und die Systemeinstellungen wie mikrofluidische Vorrichtung, mechanische Belastung und mikroskopische Bildgebung zur Charakterisierung der allmählichen Degradation der mechanischen Verformbarkeit von Erythrozyten implementiert wird.

Protokoll

Deidentifiziertes menschliches Vollblut wurde kommerziell gewonnen. Die Arbeit mit den Blutproben wurde in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 unter Verwendung von Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Biosafety Committee an der Florida Atlantic University genehmigt wurden.

1. Vorbereitung des mikrofluidischen Geräts

1. Klebe den SU-8 Master-Siliziumwafer für das mikrofluidische Kanaldesign auf der Innenseite einer 14 cm großen Petrischale aus Kunststoff ab und reinige ihn mit N₂ Gas.
2. 60 g Polydimethylsiloxan (PDMS) Base und 6 g PDMS-Härter in einen Pappbecher wiegen. Mischen Sie die beiden Teile mit einem Holzspatel, bis die Mischung eine trübe weiße Farbe hat.
3. Gießen Sie die PDMS-Mischung in die Kunststoff-Petrischale, in der sich der Siliziumwafer befindet. Stellen Sie die Petrischale in einen Vakuum-Exsikkator mit einem 3-Wege-Absperrhahn. Drehen Sie das Ventil des Absperrhahns, um das Vakuum mit der Exsikkatorkammer zu verbinden und Luftblasen aus dem PDMS zu entfernen.
4. Führen Sie wieder Luft in die Exsikkatorkammer ein, indem Sie das Absperrventil einstellen, um die Exsikkatorkammer in ca. 5-Minuten-Zyklen mit der Umgebung zu verbinden. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Luftblasen aus den Merkmalen der Kanäle entfernt sind.
5. Die Petrischale für 4 h bei 70 °C in den Ofen stellen. Nach Ablauf der Zeit die Petrischale herausnehmen, auf Raumtemperatur abkühlen lassen und auf eine Schneidematte legen.
6. Schneiden Sie mit einem Skalpell den Teil des PDMS über dem Siliziumwafer aus. Legen Sie das ausgeschnittene PDMS zwischen die beiden Blätter der Laborfolie. Der Spalt, der zwischen dem Einzug des Mikrokanals und der halbtransparenten Folie gebildet wird, erleichtert die Identifizierung der Position des mikrofluidischen Kanals sowie seines jeweiligen Ein- und Auslasses.
7. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge einen einzelnen Kanal aus dem großen PDMS heraus. Stanzen Sie ein 3 mm großes Einlassloch und ein 1,5 mm großes Auslassloch mit Biopsiestanzen entsprechend den beiden Größen (Abbildung 1A).
8. Legen Sie den gelochten Kanal mit der Kanalseite nach oben auf einen sauberen Objektträger. Platzieren Sie ein 20 mm x 15 mm großes Glassubstrat mit interdigitierten Dünnschichtelektroden aus Indiumzinnoxid (ITO) auf demselben Objektträger mit den Elektroden nach oben.
9. Legen Sie den Objektträger mit PDMS und Substrat vorsichtig in einen Plasmareiniger. Schließen Sie das Gasventil, schalten Sie den Pumpenschalter ein und warten Sie 2 Minuten, um einen Sensorwert von 600 - 800 mTorr zu erhalten.
10. Schalten Sie den Netzschalter ein und warten Sie 30 Sekunden. Drehen Sie den HF-Einschaltknopf von niedrig auf hoch und warten Sie 1 Minute.
11. Kehren Sie dann die Sequenz um, indem Sie den HF-Knopf auf Low, den Netzschalter auf OFF, den Pumpenschalter auf OFF drehen und das Gasventil öffnen.
12. Unmittelbar nach dem Öffnen der Kammer des Plasmareinigers wird das PDMS angehoben und gedreht, so dass die Kanalseite nach unten zeigt (180°). Platzieren Sie den Kanal auf der Oberseite des ITO-Substrats. Der Klebeprozess hat begonnen.
13. Drücken Sie mit einer Pinzette etwa 3 s lang vorsichtig auf die Ecken des PDMS. Vermeiden Sie es, auf den Kanal selbst zu drücken.
    HINWEIS: Der Verklebungsprozess erfolgt spontan bei physischem Kontakt zwischen den beiden behandelten Oberflächen.
14. Geben Sie das Priming-Medium in eine 1-ml-Spritze mit einer 23-G-Nadel. Befeuchten Sie den Kanal vorsichtig, indem Sie die Nadel gerade in den Einlassschacht einführen und dann das Medium freilassen. Arbeiten Sie langsam. Führen Sie keine Luftblasen ein. Mindestens 3 Minuten inkubieren.
15. Entfernen Sie das Primärmedium mit einer 10-μl-Pipettenspitze. Waschen Sie den Kanal 3 Mal mit DEP-Medium, indem Sie das DEP-Medium in den Kanal einführen. Halten Sie den Kanal immer feucht.

2. Prüfvorrichtung

HINWEIS: Die Prüfvorrichtung wird mit einer 3D-CAD-Software entworfen und besteht aus einem Basisgehäuse und einem Oberteil (Abbildung 1B). Anschließend wird es mit einer 3-Achsen-CNC-Fräsmaschine mit einer Standardtoleranzgrenze von etwa ± 0,005-Zoll-Abmessung der Prüfvorrichtung mit einem elektronischen Messschieber (nicht dargestellt) überprüft. Die Sterilität der Vorrichtung ist für die biomechanischen In-vitro-Tests nicht erforderlich.

1. Löten Sie Drähte in die Lötkelchenden von zwei Sätzen von Federkolbenverbindern vor.
2. Setzen Sie die Federkolbenverbinder in die obere Einheit ein und schaffen Sie eine dauerhafte Verbindung, indem Sie einen Tropfen Epoxidkleber hinzufügen.

3. Herstellung des Arbeitspuffers für die Elektroverformung

1. Zur Herstellung des DEP-Mediums werden 12,75 g Saccharose und 0,45 g Dextrose mit einer Waage abgewogen.
2. Lösen Sie beide Pulver in einem einzigen Behälter mit 150 ml deionisiertem Wasser (DI) und 3,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf.
3. Messen Sie die Leitfähigkeit mit einem Leitfähigkeitstester im unteren Bereich und stellen Sie sicher, dass sie 0,04 S/m beträgt (Abbildung 2).
   HINWEIS: Es kann ein anderer Leitfähigkeitswert verwendet werden, der das Vorzeichen und die Größe der resultierenden DEP-Kraft¹¹ ändern kann. Die Elektroverformung erfordert jedoch eine positive DEP-Kraft.
4. Bestätigen Sie mit einem Osmometer, dass die Osmolarität innerhalb des normalen Bereichs des Blutplasmas liegt, 275 bis 295 mOsm/kg Wasser (Abbildung 3). Bei 4 °C lagern. Das DEP-Medium ist nun vorbereitet.
5. In einem 15-ml-Röhrchen werden 0,5 g Rinderserumalbumin (BSA) in 10 ml des DEP-Mediums gelöst. Gründlich mischen. Das Primärmedium des Gerätes ist nun vorbereitet.

4. Herstellung der Zellsuspension

1. Waschen Sie 20 μl Vollblut, indem Sie das Blut mit 1 ml PBS bei 268 x g für 3 Minuten zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.
2. Resuspendieren Sie die Erythrozyten in 1 ml PBS. Zum Mischen vorsichtig pipettieren. Waschen Sie die Erythrozyten 3 Minuten lang bei 268 x g und entsorgen Sie den Überstand.
3. Extrahieren Sie 5 μl Erythrozytenpellet mit einer 10-μl-Mikropipettenspitze und dosieren Sie es vollständig in 1 ml des DEP-Mediums. Waschen Sie die Zellen, indem Sie sie 3 Minuten lang bei 268 x g zentrifugieren.
4. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Erythrozyten in 1 ml DEP-Medium. Zum Mischen vorsichtig pipettieren.
5. Waschen Sie die Erythrozyten 3 Minuten lang bei 268 x g und entsorgen Sie den Überstand. Pipettieren Sie 2 μl Erythrozytenpellet in 500 μl DEP-Medium. Die Zellsuspension wird nun mit einer Konzentration im Bereich von 62 - 104 Zellen/μL¹² hergestellt, die mit einem Standard-Zellzählobjektträger bestätigt werden kann.

5. Elektroverformungsaufbau und Ermüdungsprüfung

1. Platzieren Sie das mikrofluidische Gerät im unteren Teil der Testvorrichtung. Richten Sie den oberen Teil der Halterung am Gerät aus und montieren Sie die beiden Teile mit zwei Sätzen Nylonschrauben und Muttern (Abbildung 4).
2. Platzieren Sie die Prüfvorrichtung auf dem Mikroskoptisch. Lokalisieren Sie einen gewünschten Elektrodensatz unter dem Mikroskop.
3. Verbinden Sie das entsprechende Elektrodendrahtpaar, das zum platzierten Elektrodensatz passt, mit der Ausgangsklemme des Funktionsgenerators (Abbildung 4).
4. Entfernen Sie 5 μl des DEP-Mediums aus dem 3-mm-Einlass des mikrofluidischen Kanals. Laden Sie langsam 5 μl der Zellsuspension mit einer 10-μl-Pipettenspitze in den Einlass.
5. Lassen Sie die Zellen 1 Minute lang ruhen. Falls erforderlich, fügen Sie dem Einlass ein zusätzliches DEP-Medium hinzu, um die Zellen in den Kanal zu drücken.
6. Beobachten Sie den Kanal unter 20-facher Vergrößerung. Verwenden Sie einen 414/46-nm-Bandpassfilter, um den Kontrast der Abbildung zu verbessern.
7. Drücken Sie die Sinustaste und definieren Sie eine Sinuswelle mit einer_{RMS-Amplitude} von 2 V bei einer Frequenz von 3 MHz. Drücken Sie die Mod-Taste , um die Modulation zu aktivieren. Ändern Sie den Wellenmodus in ASK, indem Sie die Option Typ drücken.
8. Stellen Sie die Modulationsfrequenz auf 250 mHz ein, was einer Lade- und Entladezeit von 4 s entspricht (Abbildung 5A). Schalten Sie den Ausgang des Funktionsgenerators ein.
9. Nehmen Sie alle 10 Minuten ein 1-minütiges Video mit 30 Bildern pro Sekunde (fps) auf.

6. Charakterisierung der Erythrozytenverformung

1. Öffnen Sie mit einer Videobearbeitungsanwendung .avi, die im vorherigen Schritt aufgenommen wurden, indem Sie Strg+O drücken. Verwenden Sie die Zeitachse, um einen gewünschten Frame auszuwählen, und legen Sie die Start- und Endframes der Auswahl so fest, dass sie identisch sind, indem Sie die Home-Taste und dann die Endtaste auf der Tastatur drücken.
2. Exportieren Sie den Bildrahmen. Wählen Sie das Ausgabeformat JPEG aus und drücken Sie OK.
3. Öffnen Sie die Anwendung ImageJ und laden Sie die im vorherigen Schritt gespeicherten Bilder. Beginnen Sie mit dem Festlegen der erforderlichen Messungen, indem Sie auf Analysieren > Maße festlegen drücken und sicherstellen, dass die Kontrollkästchen für Fläche, Umfang und Ellipse anpassen aktiviert sind. Drücken Sie OK.
4. Konvertieren Sie als Nächstes das Bild in Graustufen, indem Sie Bild > Typ > 8-Bit auswählen.
5. Konvertieren Sie das Bild dann mit Image > Adjust > Thresholding in eine Binärdatei. Passen Sie im Dialogfeld "Schwellenwert" die beiden Schieberegler nach Bedarf an. Klicken Sie auf Übernehmen , und schließen Sie dann das Dialogfeld Schwellenwert.
6. Wählen Sie Analyze > Tools > ROI Manager aus. Aktivieren Sie im ROI-Manager das Kontrollkästchen "Alle anzeigen". Schließen Sie dieses Kästchen nicht.
7. Wählen Sie das Zauberstab-Werkzeug (Nachzeichnen) aus, wählen Sie eine entsprechende Zelle im Bild aus und drücken Sie T auf der Tastatur. Die ausgewählte Zelle wird nummeriert. Eine neue Zelle kann erneut ausgewählt werden. Wählen Sie alle zutreffenden Zellen aus, die gemessen werden sollen. Die anwendbaren Zellen werden als diejenigen identifiziert, die von anderen Zellen isoliert sind. Die Anzahl dieser Zellen kann zwischen 50 und 200 in einem einzigen Sichtfeld liegen.
8. Kehren Sie zum Feld ROI-Manager zurück, und klicken Sie auf Messen. Dadurch wird das Feld Ergebnisse geöffnet. Spalten mit den Bezeichnungen "Haupt" und "Neben" geben die Längen der angepassten Haupt- und Nebenachsen der Ellipse (in Pixeln) an. Wählen Sie Datei > Speichern unter , um die Messungen als CSV-formatierte Datei zu exportieren.
9. Berechnen Sie mit einer geeigneten Computeranalysesoftware den Quotienten aus Major und Minor.

Ergebnisse

Wenn die Zellsuspension in den mikrofluidischen Kanal geladen wurde, wurde eine relativ gleichmäßige Verteilung der Zellen beobachtet. Bei der Signalausgabe (z. B. einer einfachen Sinuswelle oder einer On-Keying-Phase von ASK) des Funktionsgenerators erzeugten die interdigitalen Dünnschichtelektroden ein ungleichmäßiges elektrisches Wechselstromfeld. Die suspendierten Zellen reagierten spontan auf diese elektrische Anregung und zeigten ein positives DEP-Verhalten, d.h. sie bewegten sich zu den Rändern von Elektrode...

Diskussion

Die ASK OOK-Modulation einer DEP-Kraft-induzierenden Sinuswelle kann verwendet werden, um die mechanische Ermüdung von Erythrozyten über einen langen Zeitraum zu testen. In diesem Protokoll haben wir die In-vitro-Ermüdungstests auf 1 Stunde begrenzt, um mögliche nachteilige metabolische Auswirkungen auf die Verformbarkeit der Zellen zu verhindern. Umfassende Ermüdungsprüfbedingungen können mit der ASK-modulierten Elektroverformungstechnik programmiert werden. Parameter wie Belastungsfrequenz, Amplitude und Belastu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance Scale	ViBRA	HT-224R
Bandpass filter	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL	Fisher Scientific	14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm	Fisher Scientific	12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm	Fisher Scientific	12-460-407	1.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gauge	BSTEAN	X001308N97
Bovin Serum Albumin	RMBIO	BSA-BSH
Centrifuge	SCILOGEX	911015119999
Conical Tube, 50 mL	Fisher Scientific	05-539-13
Dextrose	Fisher Scientific	MDX01455	MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meter	ecoTestr	358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubes	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft		Graph plotting
Function Generator	SIGLENT	SDG830
Glass/ITO Electrode Substrate	OSSILA	S161
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted Microscope	OLYMPUS	IX81 - SN9E07015
Lab Oven	QUINCY LAB (QL)	MODEL 30GCE	Digital Model
Matlab	MathWorks		Graph plotting
Micro Osmometer - Model 3300	Advanced Instruments Inc.	S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping Film	Fisher Scientific	13-374-12
Petri dish	FALCON	SKU=351006	ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)	LONZA	04-479Q
Plasma Cleaner	Harrick plasma PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		CAD software
Sucrose	Fisher Scientific	50-188-2419
Vacuum Desiccator	SPBEL-ART	F42400-2121
Wooden spatula	Fisher Scientific	NC0304136	Tongue Depressors Wood NS 6"