调幅电形成评估生物细胞的机械疲劳

摘要

这里介绍的是使用调幅电形成方法对人类红细胞进行机械疲劳测试的方案。这种通用方法可用于测量悬浮液中生物细胞形态和生物力学特性的系统变化。

摘要

红细胞（RBC）以其显着的变形性而闻名。它们在通过微循环时反复发生相当大的变形。在生理老化的红细胞中可见变形性降低。 现有的测量细胞变形性的技术不容易用于测量疲劳，即由循环负荷引起的细胞膜逐渐退化。我们提出了一种协议，用于在微流体通道中使用基于振幅偏移键控（ASK）调制的电形成来评估循环剪切应力对红细胞的机械降解。简而言之，微流体通道中的叉指电极使用信号发生器以射频的低压交流电激励。悬浮液中的红细胞响应电场并表现出正介电泳（DEP），将细胞移动到电极边缘。然后由于施加在两半电池上的力，细胞被拉伸，导致单轴拉伸，称为电形成。通过改变激励波的振幅，可以很容易地调整剪切应力的水平和由此产生的变形。这样就可以量化红细胞的非线性变形性，以响应高通量下的小变形和大变形。使用ASK策略修改激励波可诱导具有可编程负载速率和频率的循环电形成。这为表征红细胞疲劳提供了一种方便的方法。我们的ASK调制电形成方法首次能够直接测量循环载荷引起的红细胞疲劳。它可以用作一般生物力学测试的工具，用于分析其他细胞类型和患病条件下的细胞变形性和疲劳，也可以与控制细胞微环境的策略相结合，例如氧张力和生物和化学线索。

引言

红细胞（RBC）是人体中最易变形的细胞¹。它们的变形性与其携氧功能直接相关。已发现红细胞变形性降低与几种红细胞疾病的发病机制相关²。变形性测量使我们更好地了解了红细胞相关疾病³。红细胞的正常寿命可以从 70 天到 140^天不等4。因此，测量它们的变形性如何随着老化过程而降低非常重要，例如，它们由于循环剪切应力引起的疲劳行为³。

在高通量下测量红细胞变形性具有挑战性，因为皮克顿尺度力（~^10-12 N）施加到单个细胞上。在过去的十年中，已经开发了许多技术来测量细胞变形性⁵。红细胞水平的变形测量可以通过移液管抽吸和光镊进行，而批量分析则通过渗透梯度 ektacyto 仪完成。Ektacytometry分析提供了丰富的数据，这为诊断血液疾病提供了机会^6,7。红细胞的变形性也可以通过胶体探针原子力显微镜使用粘弹性理论进行分析。该方法应用计算分析来估计RBC的弹性模量，同时考虑了时变和稳态响应。单个红细胞的变形能力可以通过使用单细胞微室阵列方法进行测量。该方法通过膜....

研究方案

去识别的人全血是商业获得的。涉及血液样本的工作是在生物安全2级实验室进行的，该实验室利用佛罗里达大西洋大学机构生物安全委员会批准的协议进行。

1. 微流控装置制备

1. 在塑料 14 厘米培养皿内侧用胶带将用于微流体通道设计的 SU-8 主硅晶片用胶带粘住，并用 N₂ 气体清洁。
2. 在纸杯中称取60克聚二甲基硅氧烷（PDMS）基料和6克PDMS固化剂。用木刮刀将两部分混合，直到混合物呈白色。
3. 将PDMS混合物倒入含有硅晶片的塑料培养皿中。将培养皿放入带有3通旋塞阀的真空干燥器中。转动旋塞阀的阀门，将真空连接到干燥器室，以去除PDMS中的气泡。
4. 通过调整旋塞阀，在大约 5 分钟的周期内将干燥器室连接到环境，将空气重新引入干燥器室。重复上述步骤，直到从通道特征中去除所有气泡。
5. 将培养皿置于70°C的烤箱中4小时。时间过后，取出培养皿，让它冷却至室温，然后将其放在切割垫上。
6. 使用手术刀，切掉硅晶圆上方的PDMS部分。将切口PDMS放在两张实验室包装膜之间。微通道的压痕和半透明薄膜之间形成的间隙有助于识别微流体通道的位置及其各自的入口和出口。
7. 使用剃须刀片，从大型PDMS中切出单个通道。使用两种尺寸的活检打孔打孔3 mm入口孔和1.5 mm出口孔（图1A

讨论

DEP 力诱导正弦波的 ASK OOK 调制可用于长时间测试红细胞的机械疲劳。在该协议中，我们将体外疲劳测试限制在1小时，以防止对细胞变形能力的潜在不良代谢影响。可以使用ASK调制电形成技术对综合疲劳测试条件进行编程。加载频率、幅度和加载速率等参数都可以编程。加载频率可以编程为不同的值，以确定疲劳对加载频率的依赖性以及循环加载和静态加载之间的差异¹³。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance Scale	ViBRA	HT-224R
Bandpass filter	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL	Fisher Scientific	14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm	Fisher Scientific	12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm	Fisher Scientific	12-460-407	1.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gauge	BSTEAN	X001308N97
Bovin Serum Albumin	RMBIO	BSA-BSH
Centrifuge	SCILOGEX	911015119999
Conical Tube, 50 mL	Fisher Scientific	05-539-13
Dextrose	Fisher Scientific	MDX01455	MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meter	ecoTestr	358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubes	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft		Graph plotting
Function Generator	SIGLENT	SDG830
Glass/ITO Electrode Substrate	OSSILA	S161
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted Microscope	OLYMPUS	IX81 - SN9E07015
Lab Oven	QUINCY LAB (QL)	MODEL 30GCE	Digital Model
Matlab	MathWorks		Graph plotting
Micro Osmometer - Model 3300	Advanced Instruments Inc.	S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping Film	Fisher Scientific	13-374-12
Petri dish	FALCON	SKU=351006	ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)	LONZA	04-479Q
Plasma Cleaner	Harrick plasma PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		CAD software
Sucrose	Fisher Scientific	50-188-2419
Vacuum Desiccator	SPBEL-ART	F42400-2121
Wooden spatula	Fisher Scientific	NC0304136	Tongue Depressors Wood NS 6"