אלקטרודפורמציה מווסתת משרעת להערכת עייפות מכנית של תאים ביולוגיים

Summary

מוצג כאן פרוטוקול לבדיקת עייפות מכנית במקרה של תאי דם אדומים אנושיים באמצעות גישת אלקטרודפורמציה מווסתת אמפליטודה. גישה כללית זו יכולה לשמש למדידת השינויים השיטתיים במאפיינים מורפולוגיים וביומכניים של תאים ביולוגיים בתרחיף מעיוות מחזורי.

Abstract

תאי דם אדומים (RBCs) ידועים בעיוות יוצא הדופן שלהם. הם עוברים שוב ושוב עיוות ניכר כאשר עוברים דרך microcirculation. עיוות מופחת נראה אצל RBCs בגיל פיזיולוגי. טכניקות קיימות למדידת עיוות תאים אינן יכולות לשמש בקלות למדידת עייפות, ההתפרקות ההדרגתית בקרומי התאים הנגרמת על ידי עומסים מחזוריים. אנו מציגים פרוטוקול להערכת השפלה מכנית ב-RBCs כתוצאה מלחצים מחזוריים של גזירה באמצעות אלקטרודפורמציה מבוססת אפנון היסט משרעת (ASK) בתעלה מיקרופלואידית. בקצרה, האלקטרודות הבין-ספרתיות בתעלה המיקרופלואידית מעוררות בזרם חילופין במתח נמוך בתדרי רדיו באמצעות מחולל אותות. RBCs בתרחיף מגיבים לשדה החשמלי ומציגים דיאלקטרופורזה חיובית (DEP), המזיזה תאים לקצוות האלקטרודות. לאחר מכן נמתחים התאים בשל הכוחות החשמליים המופעלים על שני חצאי התא, וכתוצאה מכך מתיחה חד-צירית, המכונה אלקטרודפורמציה. ניתן לכוונן בקלות את רמת לחץ הגזירה ואת העיוות הנובע מכך על ידי שינוי המשרעת של גל העירור. זה מאפשר לכמת עיוות לא ליניארי של RBCs בתגובה לעיוותים קטנים וגדולים בתפוקה גבוהה. שינוי גל העירור באמצעות אסטרטגיית ASK גורם לעיוות אלקטרודלי מחזורי עם קצבי עומס ותדרים הניתנים לתכנות. זה מספק דרך נוחה לאפיון עייפות RBC. גישת האלקטרודפורמציה המווסתת ASK שלנו מאפשרת, בפעם הראשונה, מדידה ישירה של עייפות RBC מעומסים מחזוריים. הוא יכול לשמש ככלי לבדיקות ביומכניות כלליות, לניתוח עיוות תאים ועייפות בסוגי תאים אחרים ובמצבים חולים, וניתן גם לשלב אותו עם אסטרטגיות לשליטה במיקרו-סביבה של תאים, כגון מתח חמצן ורמזים ביולוגיים וכימיים.

Introduction

תאי דם אדומים (RBCs) הם התאים המעוותים ביותר בגוף האדם¹. העיוות שלהם קשור ישירות לפונקציונליות נשיאת החמצן שלהם. עיוות מופחת ב- RBCs נמצא בקורלציה עם הפתוגנזה של מספר הפרעות RBC². מדידות עיוותים הובילו אותנו להבנה טובה יותר של מחלות הקשורות ל-RBC³. תוחלת החיים הרגילה של RBCs יכולה לנוע בין 70 ל -140 יום⁴. לכן, חשוב למדוד כיצד העיוות שלהם פוחת יחד עם תהליך ההזדקנות, למשל, התנהגות העייפות שלהם עקב לחצים מחזוריים גזירה³.

מדידת עיוות RBC בתפוקה גבוהה היא מאתגרת בגלל כוחות סולם פיקוניוטון (~ ^10-12 N) המופעלים על תאים בודדים. במהלך העשור האחרון פותחו טכנולוגיות רבות למדידת עיוות התא⁵. מדידות דפורמציה של RBCs ברמת התא הבודד יכולות להתבצע על ידי שאיפת פיפטה ופינצטה אופטית, בעוד אנליזות בתפזורת נעשות על ידי ektacytometry שיפוע אוסמוטי. ניתוחי Ektacytometry מספקים שפע של נתונים, אשר מספק הזדמנות לאבחן הפרעות דם ^6,7. ניתן לנתח את העיוות של RBCs גם באמצעות התאוריה הוויסקו-אלסטית על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי של בדיקה קולואידית. בשיטה זו, ניתוח חישובי מוחל כדי להעריך את המודולוס האלסטי של RBCs, בהתחשב הן בתגובות תלויות זמן והן במצב יציב. ניתן למדוד את העיוות של RBCs בודדים באמצעות שיטת מערך microchamber תא יחיד. שיטה זו מנתחת כל תא דרך הממברנה והסמנים הפלואורסצנטיים הציטוסוליים כדי לספק מידע על עיוות RBC והתפלגות המאפיינים התאיים באוכלוסיות RBC מורכבות כדי לזהות הפרעות המטולוגיות⁸.

עייפות היא גורם מפתח בפגיעה בתכונות של חומרים מהונדסים וביו-חומרים. בדיקת עייפות מאפשרת ניתוח כמותי של שלמות ותוחלת החיים של מבנה הנתון לעומס מחזורי. ניתוח של עייפות בתאים ביולוגיים כבר זמן רב הקשו על ידי היעדר שיטה כללית, ישימה בקלות, תפוקה גבוהה, כמותית ליישום עיוות מחזורי בקרום התא. זה אפשרי עם ניצול של אפנון אות חשמלי וטכניקות אלקטרודפורמציה מיושם בסביבה microfluidic. טכניקת מפתח היסט המשרעת (ASK) כאפנון דיגיטלי מיושמת באמצעות אפנון On-Off keying (OOK) במאמר זה. הרעיון של מפתח מתייחס להעברת אותות דיגיטליים על פני הערוץ, אשר דורש אות נושא גל סינוס כדי לתפקד⁹. ניתן להגדיר את זמני ההפעלה והכיבוי באופן שווה. תחת ON-keying, RBCs נכנסים למצב מעוות כשהם נחשפים לכוח אלקטרודפורמציה חיצוני (F_dep)¹⁰ שנוצר על ידי השדה החשמלי הלא אחיד. תחת OFF-keying, RBCs נמצאים במצב רגוע שלהם. אנו רואים את העייפות של RBCs, כלומר השפלה פרוגרסיבית ביכולתם למתוח עם הגדלת מחזורי העמסה. אובדן העיוות הנגרם על ידי עייפות ב- RBCs יכול לספק תובנות לגבי הנזק המצטבר לקרום במהלך זרימת הדם, ומאפשר לנו להמשיך לחקור את הקשרים בין עייפות תאים ומצבי מחלה.

כאן אנו מספקים נהלים שלב אחר שלב כיצד בדיקות עייפות של RBCs מיושמות במכשיר מיקרופלואידי באמצעות אלקטרודפורמציה באפנון ASK והגדרות המערכת כגון התקן מיקרופלואידי, העמסה מכנית ודמיון מיקרוסקופי לאפיון ההתפרקות ההדרגתית בעיוות מכני של RBCs.

Protocol

דם שלם אנושי לא מזוהה הושג באופן מסחרי. העבודה הכוללת את דגימות הדם בוצעה במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 תוך שימוש בפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית באוניברסיטת פלורידה אטלנטיק.

1. הכנת מכשיר מיקרופלואידי

1. הדביקו את פרוסת הסיליקון הראשית SU-8 לעיצוב התעלה המיקרופלואידית בחלק הפנימי של צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 14 ס"מ ונקו אותה בגז N₂ .
2. שקלו 60 גרם בסיס פולידימתילסילוקסאן (PDMS) ו-6 גרם חומר מרפא PDMS בכוס נייר. מערבבים את שני החלקים בעזרת מרית עץ עד לקבלת צבע לבן עכור.
3. יוצקים את תערובת PDMS לתוך צלחת פטרי פלסטיק המכילה את רקיק הסיליקון. הכניסו את צלחת הפטרי למייבש ואקום עם סטופקוק תלת-כיווני. סובב את השסתום של הסטופקוק כדי לחבר את הוואקום לתא הייבוש כדי להסיר בועות אוויר מה- PDMS.
4. הכניסו מחדש אוויר לתא הייבוש על ידי התאמת שסתום הסטופקוק לחיבור תא הייבוש לסביבה תוך כ-5 דקות מחזורים. חזור על הפעולה עד שכל בועות האוויר יוסרו מתכונות הערוצים.
5. מניחים את צלחת הפטרי בתוך תנור ב 70 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. לאחר שחלף הזמן, הסירו את צלחת הפטרי, הניחו לה להתקרר לטמפרטורת החדר והניחו אותה על מחצלת חיתוך.
6. בעזרת אזמל, חותכים את החלק של PDMS מעל פרוסת הסיליקון. הניחו את המגרעת PDMS בין שתי היריעות של יריעת עטיפת המעבדה. הפער שנוצר בין כניסת המיקרו-ערוץ לבין הסרט השקוף למחצה מאפשר זיהוי מיקום התעלה המיקרופלואידית, כמו גם הכניסה והמוצא שלה.
7. באמצעות סכין גילוח, חתכו תעלה בודדת מה-PDMS הגדול. נקבו חור כניסה בקוטר 3 מ"מ וחור יציאה בקוטר 1.5 מ"מ באמצעות ניקוב ביופסיה בהתאמה לשני הגדלים (איור 1A).
8. הניחו את התעלה המנוקבת בחורים, כשצד הערוץ פונה כלפי מעלה, על מגלשת זכוכית נקייה. הניחו מצע זכוכית בגודל 20 מ"מ x 15 מ"מ המכיל אלקטרודות בין-ספרתיות מסוג Indium Tin Oxide (ITO) בעלות סרט דק על אותה שקופית זכוכית עם אלקטרודות הפונות כלפי מעלה.
9. הניחו בעדינות את מגלשת הזכוכית עם PDMS והכניסו את המצע לשואב פלזמה. סגור את שסתום הגז, הפעל את מתג המשאבה והמתן 2 דקות כדי לקבל קריאת חיישן של 600 - 800 mTorr.
10. הפעל את מתג ההפעלה והמתן 30 שניות. סובב את ידית ההפעלה RF מנמוך לגבוה והמתן דקה אחת.
11. לאחר מכן, הפוך את הרצף על ידי סיבוב ידית ה- RF לנמוכה, מתג הפעלה ל- OFF, מתג המשאבה לכבוי ופתיחת שסתום הגז.
12. מיד לאחר פתיחת התא של מנקה הפלזמה, הרימו וסובבו את ה-PDMS כך שצד התעלה פונה כלפי מטה (180°). הניחו את התעלה על גבי מצע ה-ITO. תהליך הבונדינג החל.
13. בעזרת פינצטה, לחץ בעדינות כלפי מטה על פינות PDMS במשך כ -3 שניות. הימנע מלחיצה על הערוץ עצמו.
    הערה: תהליך ההדבקה מתרחש באופן ספונטני במגע פיזי בין שני המשטחים המטופלים.
14. לטעון את המדיום priming לתוך מזרק 1 מ"ל עם מחט 23 גרם. בזהירות להרטיב את התעלה על ידי החדרת המחט ישר לתוך הכניסה היטב ולאחר מכן לשחרר את המדיום. לפעול לאט. אין להכניס בועות אוויר. יש לדגור במשך 3 דקות לפחות.
15. מוציאים את המדיום הראשוני בעזרת קצה פיפטה 10 μL. שטפו את הערוץ באמצעי DEP 3 פעמים על-ידי הכנסת מדיום DEP לערוץ. שמור על הערוץ רטוב בכל עת.

2. מתקן בדיקה

הערה: מתקן הבדיקה תוכנן באמצעות תוכנת CAD תלת-ממדית וכולל יחידת דיור בסיסית ויחידה עליונה (איור 1B). לאחר מכן, הוא מיוצר באמצעות מכונת כרסום CNC בעלת 3 צירים עם מגבלת סובלנות סטנדרטית של כ -± ממד 0.005 אינץ 'של מתקן הבדיקה נבדק באמצעות קליפר אלקטרוני (לא מוצג). סטריליות של המתקן אינה נדרשת לבדיקה ביומכנית במבחנה.

1. חוטי הלחמה מראש לקצוות ההלחמה של שני סטים של מחברי בוכנה קפיציים.
2. הכנס את מחברי הבוכנה הקפיציים ליחידה העליונה וצור הדבקה קבועה על ידי הוספת טיפה של דבק אפוקסי.

3. הכנת חיץ עבודה אלקטרודפורמציה

1. כדי להכין את המדיום DEP, לשקול 12.75 גרם של סוכרוז ו 0.45 גרם של דקסטרוז באמצעות סולם.
2. יש להמיס את שתי האבקות במיכל יחיד עם 150 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה (DI) ו-3.5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS).
3. באמצעות בודק מוליכות לטווח נמוך, מדוד את המוליכות וודא שהיא 0.04 S/m (איור 2).
   הערה: ניתן להשתמש בערך מוליכות שונה, אשר עשוי לשנות את הסימן ואת הגודל של כוח DEP¹¹ המתקבל. אלקטרודפורמציה, לעומת זאת, דורשת כוח DEP חיובי.
4. באמצעות אוסמומטר, אשרו שהאוסמולריות נמצאת בטווח הנורמלי של פלסמת הדם, 275 עד 295 mOsm/kg מים (איור 3). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. מדיום ה-DEP מוכן כעת.
5. בצינור של 15 מ"ל, יש להמיס 0.5 גרם אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-10 מ"ל של מדיום DEP. מערבבים היטב. המדיום העיקרי של המכשיר מוכן כעת.

4. הכנת השעיית תאים

1. לשטוף 20 μL של הדם כולו על ידי צנטריפוגה הדם עם 1 מ"ל של PBS ב 268 x גרם במשך 3 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
2. להשעות מחדש את RBCs ב 1 מ"ל של PBS. פיפטה עדינה לערבוב. שטפו את RBCs במשך 3 דקות ב 268 x גרם והשליכו את supernatant.
3. לחלץ 5 μL של גלולת RBC באמצעות קצה micropipette 10 μL ולהוציא באופן מלא לתוך 1 מ"ל של מדיום DEP. לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 268 x גרם במשך 3 דקות.
4. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את ה-RBCs ב-1 מ"ל של מדיום DEP. פיפטה עדינה לערבוב.
5. שטפו את RBCs במשך 3 דקות ב 268 x גרם והשליכו את supernatant. פיפטה 2 μL של גלולת RBC לתוך 500 μL של מדיום DEP. תרחיף התא מוכן כעת עם ריכוז בטווח של 62 - 104 תאים / μL¹², אשר ניתן לאשר באמצעות שקופית ספירת תאים סטנדרטית.

5. הגדרת אלקטרודפורמציה ובדיקת עייפות

1. הניחו את המכשיר המיקרופלואידי בחלק התחתון של מתקן הבדיקה. ישרו את החלק העליון של גוף התאורה למכשיר והרכיבו את שני החלקים באמצעות שני סטים של ברגי ניילון ואומים (איור 4).
2. הניחו את מתקן הבדיקה על במת המיקרוסקופ. אתר קבוצה רצויה אחת של אלקטרודות מתחת למיקרוסקופ.
3. חברו את זוג חוטי האלקטרודות המתאימים המתאימים לאלקטרודה הממוקמת למסוף הפלט של מחולל הפונקציות (איור 4).
4. הסר 5 μL של תווך DEP מכניסת 3 מ"מ של התעלה המיקרופלואידית. טען באיטיות 5 μL של מתלה התא לתוך הכניסה באמצעות קצה פיפטה 10 μL.
5. אפשר לתאים להתיישב למשך דקה אחת. במידת הצורך, הוסף אמצעי DEP נוסף לכניסה כדי לדחוף תאים לתוך הערוץ.
6. צפו בערוץ תחת הגדלה של פי 20. השתמש במסנן פסים של 414/46 ננומטר כדי לשפר את ניגודיות ההדמיה.
7. לחץ על לחצן סינוס והגדר גל סינוס עם משרעת_RMS של 2 V בתדר 3 MHz. לחץ על לחצן Mod כדי לאפשר אפנון. שנה את מצב הגל ל- ASK על-ידי לחיצה על האפשרות סוג .
8. הגדר את תדר האפנון ל- 250 MHz, המתאים לתקופת טעינה-פריקה של 4 שניות (איור 5A). הפעל את הפלט של מחולל הפונקציות.
9. הקלט סרטון של דקה אחת כל 10 דקות ב- 30 פריימים לשנייה (fps).

6. אפיון עיוות RBC

1. באמצעות יישום עריכת וידאו, פתח .avi קבצים שהוקלטו בשלב הקודם על-ידי הקשה על Ctrl+O. השתמש בציר הזמן כדי לבחור מסגרת עניין והגדר את מסגרת ההתחלה והסיום של הבחירה כך שיהיו זהות על-ידי הקשה על מקש Home ולאחר מכן על מקש End בלוח המקשים.
2. יצא את מסגרת התמונה. בחר את פורמט הפלט להיות JPEG ולחץ אישור.
3. פתח את היישום ImageJ וטען את התמונות שנשמרו בשלב הקודם. התחל על-ידי הגדרת המידות הדרושות על-ידי הקשה על נתח > הגדר מדידות וודא שתיבות הסימון עבור שטח, היקף והתאמה אליפסה מסומנות. לחץ על אישור.
4. לאחר מכן, המירו את התמונה לגווני אפור באמצעות בחירה באפשרות 'תמונה' > 'סוג' > 8 סיביות.
5. לאחר מכן המירו את התמונה לבינארית באמצעות Image > Adjust > Thresholding. בתיבת הדו-שיח סף, התאם את שני המחוונים לפי הצורך. הקש החל ולאחר מכן סגור את תיבת הדו-שיח סף.
6. בחר נתח כלי > > מנהל החזר ההשקעה. במנהל החזר ההשקעה, לחץ על תיבת הסימון הצג הכל. אל תסגור תיבה זו.
7. בחרו בכלי שרביט (עקיבה), בחרו תא מתאים בתמונה והקישו T במקלדת. התא שנבחר יהיה ממוספר. ניתן לבחור שוב תא חדש. בחר את כל התאים הרלוונטיים למדידה. התאים הרלוונטיים מזוהים כתאים המבודדים מתאים אחרים. מספר התאים האלה יכול לנוע בין 50 ל-200 בשדה ראייה יחיד.
8. חזור לתיבה מנהל החזר ההשקעה ולחץ על מדידה. פעולה זו פותחת את התיבה תוצאות. עמודות המסומנות כ'מז'ור' ו'מינורי' הן האורכים של האליפסה המותאמת צירים ראשיים ומינוריים (בפיקסלים), בהתאמה. בחרו ' קובץ' >'שמור בשם ' כדי לייצא את המידות כקובץ בתבנית CSV.
9. באמצעות כל תוכנת ניתוח חישובית מתאימה, לחשב את המנה של מז'ור ומינור.

תוצאות

כאשר תרחיף התא הועמס בתעלה המיקרופלואידית, נצפתה התפלגות אחידה יחסית של תאים. עם יציאת האות (למשל, גל סינוס פשוט או שלב On-Keying של ASK) ממחולל הפונקציות, האלקטרודות האינטרדיגיטציה בעלות הסרט הדק יצרו שדה חשמלי לא אחיד של זרם חילופי. התאים המרחפים הגיבו באופן ספונטני לעירור חשמלי זה והפגינו התנ?...

Discussion

ניתן להשתמש באפנון ASK OOK של גל סינוס מעורר כוח DEP כדי לבדוק את העייפות המכנית של RBCs לאורך תקופת זמן ארוכה. בפרוטוקול זה, הגבלנו את בדיקת עייפות החוץ גופית לשעה אחת כדי למנוע את ההשפעות המטבוליות השליליות האפשריות על עיוות התא. ניתן לתכנת תנאי בדיקת עייפות מקיפים באמצעות טכניקת אלקטרודפורמצי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance Scale	ViBRA	HT-224R
Bandpass filter	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL	Fisher Scientific	14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm	Fisher Scientific	12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm	Fisher Scientific	12-460-407	1.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gauge	BSTEAN	X001308N97
Bovin Serum Albumin	RMBIO	BSA-BSH
Centrifuge	SCILOGEX	911015119999
Conical Tube, 50 mL	Fisher Scientific	05-539-13
Dextrose	Fisher Scientific	MDX01455	MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meter	ecoTestr	358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubes	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft		Graph plotting
Function Generator	SIGLENT	SDG830
Glass/ITO Electrode Substrate	OSSILA	S161
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted Microscope	OLYMPUS	IX81 - SN9E07015
Lab Oven	QUINCY LAB (QL)	MODEL 30GCE	Digital Model
Matlab	MathWorks		Graph plotting
Micro Osmometer - Model 3300	Advanced Instruments Inc.	S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping Film	Fisher Scientific	13-374-12
Petri dish	FALCON	SKU=351006	ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)	LONZA	04-479Q
Plasma Cleaner	Harrick plasma PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		CAD software
Sucrose	Fisher Scientific	50-188-2419
Vacuum Desiccator	SPBEL-ART	F42400-2121
Wooden spatula	Fisher Scientific	NC0304136	Tongue Depressors Wood NS 6"